邢奋丽 邓毅 王林娥 曹克利

即早基因c-Jun是丝裂素活化蛋白激酶信号转导通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成分，与神经元凋亡过程密切相关，负责凋亡早期触发阶段的信号放大及传递，其表达可导致神经元死亡[1]。c-Jun在机体其他组织的表达已有报道[2，3]，但c-Jun在豚鼠耳蜗细胞损伤中的研究尚不多见。为此，本实验给豚鼠腹腔注射顺铂，以制备感音神经性聋的动物模型，用免疫组织化学染色方法，观察c-Jun在正常豚鼠耳蜗细胞的表达及耳蜗细胞凋亡时发生的改变，初步探讨c-Jun在耳蜗细胞凋亡中的意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物和分组 选健康白毛红目豚鼠20只，体重250～350 g，雌雄不限，耳廓反射灵敏，无中耳炎，由中国医学科学院实验动物研究所提供，于北京协和医院实验动物中心洁净饲养。动物适应性喂养3天后，随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组腹腔注射顺铂4 mg·kg-1·d-1，连续4天，每天测体重以调整药量。对照组每天腹腔注射等量生理盐水。在给药4天后24小时内处死动物，每组均取动物的左侧耳蜗制作石蜡切片，余备他用。

1.2实验仪器和试剂 本实验主要仪器有：GSI Audera 听觉脑干诱发电位测试系统；GSI TIP50插入式耳机；手术显微镜(云南光学仪器厂)；Olympus 光学显微镜。主要试剂：注射用顺铂粉剂(10 mg/支，齐鲁制药厂)10 ml生理盐水溶解，配成1 mg/ml溶液；10%水合氯醛；细胞凋亡检测试剂盒(POD,武汉博士德生物有限公司 MK 1020)；二氨基联苯胺(DAB,中山公司)；一抗为c-Jun(H-79)兔多克隆抗体IgG(sc-1694)；二抗为羊抗兔抗体Envision(Dako 基因公司,即用型)。

1.3实验方法

1.3.1ABR检测 所有动物在最后一次给药后24 h内测试听性脑干反应，具体步骤：将动物置隔声电屏蔽室内，10%水合氯醛3～4 ml/kg腹腔注射麻醉满意后，将针形记录电极置豚鼠颅顶正中皮下，参考电极置同侧乳突区，鼻尖接地，使针形电极和皮肤之间的电阻<5 kΩ；GSI TIP50型插入式耳机给声，用100 μs、极性交替的短声(click)作刺激声，刺激重复率11.1次/秒，滤波范围150～3 000 Hz，扫描时间10 ms，叠加253次；声刺激强度自110 dB SPL开始，按10 dB一档下降，接近反应阈时，每次减少5 dB,以能引出可重复的波I的最小刺激声强度为反应阈。到反应阈时，每耳测3次，取均数作为反应阈值，比较每组动物给药前后ABR反应阈值、阈移变化。

1.3.2电镜标本制备 将动物全麻下断头处死取出听泡，2.5%戊二醛灌流固定，1%锇酸后固定，常规制备扫描标本，日本电子SEM-6000F型扫描电镜观察样品；另外，常规制备透射电镜标本，超薄切片，厚度约60 nm，日本电子JEM-1010透射电镜观察。

1.3.3石蜡切片制作及HE染色 取出左耳听泡，于手术显微镜下打开，常规切片，厚度为5～6 μm，玻片用多聚赖氨酸处理。取中轴切片，每隔5张选一张，每个标本选2张进行凋亡细胞检测，2张做c-Jun蛋白染色，余下的切片每组动物中每个指标各选2张做阴性对照。组织切片HE染色，证实为完整的耳蜗组织，光镜下观察。

1.3.4原位检测凋亡细胞及TUNEL阳性细胞半定量分析 用细胞凋亡检测试剂盒，采用原位染色TUNEL法检测凋亡细胞，操作参考试剂盒推荐方法稍加改动。结果在显微镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞，于200倍光镜下观察分析每张切片底回蜗轴两侧Corti器细胞，用北航数码医学图像处理软件，单点分割图像，记录阳性细胞总数。

1.3.5c-Jun蛋白免疫组化染色(二步法)及结果判定 石蜡切片，二甲苯脱蜡，3%过氧化氢室温孵育；下行梯度酒精水化至水；PBS冲洗；抗原修复；滴加适当比例稀释的一抗(预实验选定一抗稀释度为c-Jun 1:300)，室温孵育，PBS冲洗；滴加二抗：羊抗兔Envision，PBS冲洗；DAB显色，显微镜控制；苏木素复染；盐酸酒精分化；氨水返兰；上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，细胞内有棕黄色颗粒者为阳性细胞。用北航数码医学图像分析软件，单点分割图像，体视学分析，每张切片用平均光密度值(mean optical density，MOD)代表该切片的染色强度，于200倍光镜下对每张切片底回蜗轴两侧Corti器细胞进行分析，每个标本选两张切片，取其平均值作为该标本的染色强度。

1.4统计学方法 使用SPSS11.0统计软件分析，对各组动物给药前后ABR阈值差进行成组设计t检验；对TUNEL标记阳性细胞记数结果用成组设计两样本比较的秩和检验(Mann-Whitney U test)；两组动物细胞内c-Jun蛋白表达的数据比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1实验组和对照组ABR反应阈 实验组动物给药前后ABR反应阈分别为37.75±5.50和54.25±9.07 dB SPL(t=6.628,P<0.05)，对照组动物给药前后ABR阈值分别为37.00±6.16和39.50±4.26 dB SPL(t=1.602,P>0.05)，实验组ABR阈移为16.00±10.71 dB，对照组ABR阈移为1.75±6.12 dB，两组阈移比较差异有统计学意义(t=5.164,P<0.05)，说明实验组豚鼠发生了感音神经性聋。

2.2电镜观察结果 扫描电镜见实验组耳蜗毛细胞散乱、倒伏，毛细胞纤毛周围渗出物形成网状结构，而对照组毛细胞纤毛周围无网状结构包绕附着；透射电镜见实验组毛细胞呈现出凋亡改变，表现为核内染色质边聚，对照组细胞形态结构正常，没有明显凋亡变化(图1、2)。

2.3HE染色观察结果 与对照组相比，实验组Corti器细胞数目减少，排列散乱，细胞体积变小(图3)。

2.4原位染色检测结果 实验组Corti器细胞数目减少，排列散乱，细胞体积变小，同时可见明显的凋亡阳性细胞，对照组凋亡细胞染色几乎均为阴性，只在个别支持细胞有弱阳性，阴性对照片细胞均未着色。统计结果：实验组10例耳蜗Corti器的TUNEL阳性细胞数分别为1.0、2.0、1.5、1.0、2.5、0.5、3.0、0.0、3.5、4.0，对照组Corti器的TUNEL阳性细胞数分别为0.5、0.0、1.0、0.0、0.75、0.0、0.5、0.25、0.0和0.0，经秩和检验，两组Corti器TUNEL阳性细胞数相比，差异有统计学意义(Z为-2.959，P<0.05)(图4)。

2.5c-Jun蛋白表达检测结果 对照组中，c-Jun蛋白在内耳广泛分布，包括螺旋神经节细胞和Corti器细胞，蜗轴神经未见表达，Corti器中部分支持细胞也有表达，染色较浅；实验组中，Corti器细胞c-Jun染色明显增强，以胞核明显，同时细胞体积变小(图5)。实验组和对照组Corti器细胞c-Jun的MOD值分别为0.51±0.08和0.33±0.07，实验组耳蜗细胞c-Jun表达明显增强(t=5.359，P<0.05)。

图1两组豚鼠耳蜗扫描电镜图a 对照组耳蜗毛细胞纤毛周围无渗出(扫描电镜×850),b 实验组毛细胞纤毛周围有渗出，形成网状结构(扫描电镜×550)

图2两组豚鼠耳蜗透射电镜图a 对照组毛细胞形态正常，核内染色质分布均匀,b 实验组毛细胞体积变小，核膜皱缩，染色质边聚(透射电镜×5 000)

图3两组豚鼠耳蜗HE染色图a 对照组耳蜗Corti器细胞形态规则，排列整齐,b 实验组Corti器细胞，数目减少，排列散乱(HE×400)

图4原位染色结果a 对照组耳蜗Corti器细胞TUNEL染色，毛细胞和支持细胞均为阴性,b 实验组Corti器细胞TUNEL染色，外毛细胞和部分支持细胞核显棕色，为阳性细胞(×200)

图5 c-Jun蛋白表达免疫组化染色图a 对照组c-Jun在Corti器内外毛细胞染色较弱，部分支持细胞染色也表现为弱阳性，b 实验组c-Jun在Corti器细胞表达增强，支持细胞和外毛细胞染色加深明显(免疫组化染色×400)

3 讨论

顺铂是常用的抗肿瘤药，尤其对实体瘤和对一般化疗不甚敏感的肿瘤疗效显著，临床应用十分广泛。但其有严重肾功能损伤、耳毒性等不良反应，严重影响患者化疗期及化疗后的生活质量[4]。近年来，在顺铂的结构基础上，合成了大量的顺铂类似物，但总体抗肿瘤水平都没有超过顺铂，而且抗瘤谱窄，所以，暂不可能取代顺铂。为减小顺铂的毒副作用，顺铂的耳毒性机制一直是耳科学领域研究热点之一。

多年来豚鼠一直被用于内耳实验，主要由于不同哺乳动物对耳毒性药物的敏感性不同，而豚鼠对耳毒性药物最敏感，损伤后内耳的变化与人类损伤后相似，而且豚鼠内耳体积大，操作容易。因此本实验选用豚鼠，在顺铂导致豚鼠耳聋后，观察耳蜗Corti器细胞凋亡及c-Jun在豚鼠耳蜗的表达情况。

研究发现，顺铂引起耳毒性主要为不可逆的感音神经性聋[4]，临床上听力损失以高频为主，双侧对称，逐渐波及中低频区。顺铂在内耳淋巴中维持高浓度，首先损伤外毛细胞，其中第一排外毛细胞受损最重，而且病变从底回开始，逐渐向蜗尖发展。本实验给豚鼠腹腔注射顺铂制备感音神经性聋动物模型，发现实验组豚鼠ABR反应阈显著提高，阈移明显大于对照组，石蜡切片和电镜扫描观察结果显示，顺铂导致动物耳蜗细胞形态结构发生明显改变，耳蜗细胞中出现凋亡细胞。

一般情况下，细胞内存在少量c-Jun蛋白，参与细胞的信息传递等生理过程，不同的生理和病理性刺激如缺血、缺氧、射线辐射、应激等可以诱导其表达增加，c-Jun表达变化与某些疾病的发生发展有密切关系，而且参与了应激导致的神经细胞的凋亡变化[5]。本实验发现，正常情况下，c-Jun弥散分布在Corti器的部分毛细胞、支持细胞中，表达较弱，胞核中表达不明显，耳蜗细胞发生凋亡时可见c-Jun蛋白表达水平明显增高，胞核中表达尤其明显，推测c-Jun可能参与了顺铂导致的耳蜗细胞凋亡。JNK/c-Jun途径在内耳研究中被认为是引起氧化应激导致听觉神经元凋亡的主要因素[6，7]，结合目前研究，推测顺铂是通过增加氧化应激产物如ROS、NO、Ca2+等激活JNK/c-Jun通路，使c-Jun表达增强并转位入核所致，在细胞核内c-Jun与自身、cfos或活化转录因子2(activating transcription factor-2,ATF2)等形成同源或异源二聚体，并结合到有与转录激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)特异结合位点的凋亡相关的下游基因DNA调节区，进而调节靶基因的表达和转录速度，导致细胞凋亡[8，9]，从而引起感音神经性聋。

目前，c-Jun是丝裂素活化蛋白激酶信号转导通路的一个干预治疗的潜在分子靶[10]，本实验初步发现凋亡耳蜗细胞的c-Jun表达高于正常耳蜗，但是c-Jun在耳蜗细胞凋亡过程中的动态变化及与其他MAPK分子之间的关系需要进一步研究，以便为临床上感音神经性聋的防治提供实验基础。

4 参考文献

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7 许辉杰，黄魏宁. 顺铂作用下沙鼠耳蜗螺旋神经节神经元和Corti器细胞的凋亡[J].中华耳鼻咽喉科杂志,2003，38：98.

8 Marek KW, Kurtz LM, Spitzer NC. c-Jun integrates calcium activity and tlx3 expression to regulate neurotransmitter specification[J]. Nat Neurosci,2010,13:944.

9 Lefebvre P ,Malgrange B, Lallemend F,et al. Mechanisms of cell death in the injured auditory system:otoprotective strategies[J]. Audiol Neurotol, 2002, 7:165.

10 Martin LJ,Bergeron F,Viger RS,et al. Functional cooperation between GATA factors and c-Jun on the star promoter in MA-10 leyclig cells[J]. J Androl,2012,33:81.