赵卫卫，彭 攸，李晓娇，卢晓佳，王玉平，刘萃萃，王璐璐，冯 景

(南方医科大学附属奉贤医院检验科，上海201400)

EZH2基因是人们新近认识的一种人类基因，定位于染色体7q35，是一种转录阻遏因子，可抑制抑癌基因的活性，具有促进多种肿瘤的转移特征［1-2］。大量研究表明，乳腺癌发生、发展与EZH2基因密切相关［3-6］。进一步研究表明，miRNAs对 EZH2的表达有重要的调控作用［7-8］。miRNA是一种不编码蛋白的单链小分子RNA，其通过完全或不完全地与靶mRNA的3'UTR互补结合，引起靶基因的翻译抑制或切割降解，从而调控基因的表达［9］。本研究尝试将 EZH2基因3'UTR序列定向克隆到慢病毒筛选载体上，构建携带EZH2基因3'UTR的慢病毒筛选载体，在包装质粒的辅助作用下包装成慢病毒颗粒，并转染乳腺癌细胞株MCF-7，获得稳定表达EZH2 3'UTR的细胞株，为后续的筛选miRNAs奠定基础。

材料和方法

一、材料

293T细胞株、乳腺癌细胞株MCF-7(上海中科院提供);pMD19-T载体(TaKaRa公司);CTX靶点筛选系统慢病毒表达载体及包装质粒(SBI公司);Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Promega公司);DNA连接酶、限制性内切酶BamHI和EcoR I(TaKaRa公司);RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒(QIAGEN公司);Lipofecter脂质体转染试剂(碧云天公司);Marker-DL2000、低熔点琼脂糖(上海生物工程公司)。

二、方法

1.EZH2 3'UTR重组筛选载体的构建 查询PubMed数据库(www.PubMed.com)查找人EZH2 mRNA序列，根据EZH2 3'UTR序列信息设计引物。引物序列 上游P5:5'-CT(保护碱基)GGATCC(划线部分为BamHI酶切位点)CATCTGCTACCTCCTCC-3'，下游P3:5'-CA(保护碱基)GAATTC(划线部分为 EcoRI酶切位点)GATTCAACAAGGACAAGTT-3'。抽提乳腺癌组织总RNA，进行逆转录PCR反应。反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。对CTX-Lentivirus空质粒和pMD19T-EZH2 3'UTR重组质粒分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，酶切产物在T4DNA连接酶作用下与16℃连接1h。……