王丽美，王 平，孙吉康，程 鹏，费明亮

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

HPLC法测定单面针药材中白鲜碱含量

王丽美，王 平，孙吉康，程 鹏，费明亮

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004）

本文成功地建立了一种测定单面针药材中白鲜碱含量的高效液相色谱（HPLC）分析方法。样品采用超声波辅助提取，色谱柱为SinoChrom ODS-BP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠缓冲液（50 : 50）为流动相，流速0.8 mL/min，在波长236 nm处进行白鲜碱含量检测。实验结果表明，白鲜碱在进样量为0.001 5～0.200 0 μg 范围内，峰面积和质量浓度呈良好的线性关系（R2＝0.9995）；平均回收率为98.8%；相对标准偏差（RSD）为3.06%（n＝6）。该法准确可靠、重现性好，可用于对不同产地、不同药用部位单面针中白鲜碱含量的测定。

单面针；白鲜碱；HPLC；含量测定

中药材单面针，学名蚬壳花椒Zanthoxylum Dissitum Hemsl，又名山枇杷、蚌壳花椒、大叶花椒等[1]，属芸香科花椒属常绿攀援或蔓生木质藤本灌木植物，是我国南方重要的珍稀木本药用植物资源[2]。根、茎及叶均供药用，能祛风活络、散瘀止痛、解毒消肿，现已被开发为妇科千金片、妇科外用洗液等[3]。单面针中主要含有白鲜碱、γ-花椒碱多种生物碱[4-5]、内酯类[3]和黄酮类化合物[6]等。

白鲜碱主要存在于芸香科植物白鲜的根皮中，具有抗菌[7]、抗病毒[8]和抗昆虫[9]等活性。近年来有研究表明白鲜碱具有良好的抗癌活性，在UV灯照射下白鲜碱能与DNA双螺旋结构中的嘧啶碱基形成加合物，此性质与治疗牛皮癣药物8-甲氧补骨脂素相类似[10]。早在1995年汤俊等首次报道了蚬壳花椒中含有白鲜碱并成功得到了白鲜碱的单体，但有关单面针药材中白鲜碱的含量测定方法至今未见报道。本文采用高效液相色谱分析法，以产于湖北恩施、湖南张家界和贵州铜仁3个主产区的单面针和经人工快繁栽培于长沙的单面针为材料，首次测定了单面针根、茎部白鲜碱的含量，方法简单易行，准确率高，以期为单面针药材的科学利用提供参考，为评价和控制单面针药材的内在质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

单面针供试样品分为野生资源和人工栽培两类，野生样品源自湖北恩施、湖南张家界、贵州铜仁3个单面针药材主产区，由张家界市百草中药材开发有限公司提供；人工栽培的单面针采自中南林业科技大学植物园，由该校王平教授课题组经人工快繁栽培而得。所有供试样品均由中南林业科技大学喻勋林教授鉴定为芸香科花椒属单面针药材Zanthoxylum Dissitum Hemsl4年生植物，均达到企业入药标准。取单面针根、茎，干燥后粉碎，过80目筛备用。对照品白鲜碱（中国药品生物制品检定所，批号：111654-200301），乙腈（西安化学试剂厂，色谱纯），磷酸二氢钠（分析纯），超纯水（自制）。

Agilent 1200 高效液相色谱仪（包括VWD紫外可变波长检测器，四元低压梯度泵，真空脱气机），ELGA超纯水仪，紫外分光光度计（UV-2450）、超声波清洗仪（上海声彦超声波仪器有限公司SCQ25-6），电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司AL204），万能粉碎机（温岭市林大机械有效公司DFY-01）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

依利特SinoChrom ODS-BP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠缓冲（50∶50），柱温为25 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为236 nm，进样量20 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品白鲜碱 10 mg置于10 mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的对照品溶液，4 ℃备存。

1.2.3 供试品溶液的制备

分别取不同产地的单面针根、茎部样品粉末，约0.25 g，精密称量，分别加80%乙醇20 mL，超声提取30 min，提取液在5 000 转/分下离心10 min，水浴挥发溶剂并定容至5 mL容量瓶，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

取白鲜碱对照品溶液和单面针样品溶液在190～ 400 nm 波长范围内扫描, 最大吸收波长分别为232 nm 和222 nm，扫描图见图1(A)、(B)。综合实验结果，选择236 nm 作为检测波长。

图1 白鲜碱对照品溶液紫外扫描( A图 ) 和单面针根部样品溶液紫外扫描（B图）Fig. 1 Ultraviolet and visible absorption spectrum of dictamnine reference substance (A) and that of Z. dissitum root samples (B)

2.1.2 流动相及流速的确定

我们比较了流动相乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(45∶55)，v=1.0 mL/min；乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(45∶55)，v=0.8 mL/min；乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(50∶50)，v=0.8 mL/min 3个比例对样品的分离，结果显示，当乙腈和磷酸二氢钠缓冲液的比例达到50∶50，流速v=0.8 mL/min时可以使样品分离达到要求，且保留时间较短，故最终选择乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(50∶50)，v=0.8 mL/min作为检测条件。

白鲜碱对照品溶液及单面针供试品溶液在前述最佳洗脱条件下进样测定，得色谱图(图2(A)、(B))。由图可得，白鲜碱峰形对称、尖锐，具有良好的分离效果。

2.2 线性关系考察

图2 白鲜碱对照品溶液色谱( A ) 和单面针根部样品溶液( B ) 色谱Fig. 2 HPLC chromatograms of dictamnine reference substance (A) and that of Z. dissitum root samples (B)

精密称取白鲜碱对照品溶液1 mL置100 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.01 mg/mL的标准品贮备液。精密吸取浓度为0.01 mg/mL的标准品贮备液1、2.5、5、7.5、10 mL分别置10 mL 量瓶中，加80%乙醇稀释至刻度，摇匀，分别制成含白鲜碱0.001、0.002 5、0.005、0.007 5、0.01 mg/mL的标准品溶液。再从0.007 5 mg/mL溶液中精密吸取1 mL，置100 mL 量瓶中，加80%乙醇稀释至刻度，摇匀，制成含白鲜碱0.075 μg/mL的标准品溶液。分别精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以白鲜碱标准品含量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=19 206X+62.031（R2=0.999 5），表明在0.001 5～0.2 μg范围内，白鲜碱的峰面积积分值与含量有良好的线性关系。

2.3 精密度试验

精密吸取白鲜碱对照品溶液20 μL，按照1.2.1所述色谱条件，注入高效液相色谱仪，重复进样5次，测定白鲜碱峰面积值，结果RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取张家界产的单面针根部粉末，按供试品溶液的制备方法配制成供试品溶液，按照1.2.1所述色谱条件，分别于第0、2、4、6、8 h精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图。结果由峰面积计算RSD= 2.47%，表明本实验样品溶液在8 h内稳定。

2.5 重复性试验

取张家界产的单面针根部粉末，依法分别制备5份供试品溶液，按照1.2.1所述色谱条件进样测定，其RSD为0.99%，表明本法重现性良好。

2.6 加样回收率试验

取张家界产的单面针根部粉末按前述方法重复测定白鲜碱的含量(n=3)，同时再按高、中、低3种浓度梯度分别做加标样品分析（n=6），进样测定含量，白鲜碱平均回收率为98.8%，RSD为3.06% (n= 6)，结果见表1。

表1 单面针中白鲜碱加样回收率Table 1 Adding sample recovery rate of dictamnine in Z. dissitum (n=6)

2.7 单面针样品白鲜碱含量测定

按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，测定并比较湖南张家界、湖北恩施、贵州铜仁产单面针和湖南长沙人工栽培的单面针根、茎部白鲜碱的含量，每一份样品平行测定三次，记录白鲜碱面积积分值，外标法计算白鲜碱的平均含量，结果见表2。

表2 不同产地单面针根、茎部白鲜碱的含量Table 2 Contents of dictamnine in roots and stems of Z.Dissitum from different production habitats

对以上数据运用SPSS13.0软件进行方差分析可知，同一产地的单面针中白鲜碱含量具有一定的器官特异性，普遍表现为根部含量高于茎部，平均高达18.20倍；与野生单面针相比，人工栽培于长沙的单面针中白鲜碱含量较低，但是根、茎部含量相差较小；不同产地单面针根部白鲜碱含量呈极显著差异（P＜0.01），湖北恩施和贵州铜仁茎部含量差异不显著（P=0.279＞0.05）。综合比较单面针根、茎部白鲜碱含量情况，建议制药企业宜多选用湖南张家界地区单面针药材，可确保良好的药材品质和质量。

3 讨论与结论

现阶段国内尚未有统一的白鲜碱含量测定标准，现有文献报道的检测白鲜碱的方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法等。相比较其他方法，HPLC法具有直接、快速、简便的特点，现已广泛应用于中药成分的检测中[11-12]。李艳园[13]、王森[14]等采用HPLC法检测白鲜皮和其制剂中白鲜碱的含量，黄端华等[15]建立了毛细管电泳-紫外检测法同时分离检测白鲜皮中葫芦巴碱、白鲜碱和胆碱的分析体系，但这些样品中白鲜碱的含量较高。目前对单面针药材中白鲜碱的精确、定量分析鲜见文献报道。

本文成功地建立了一种测定白鲜碱含量的高效液相色谱法，并对不同产地、不同部位的单面针中白鲜碱含量进行测定和比较。采用80%乙醇超声辅助提取，最佳色谱条件为：以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠缓冲液（50:50）为流动相，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，在236 nm波长处进行检测。方法简便易行，数据可靠，为单面针药材的质量检测标准提供了一种科学的、可行的检测方法，同时该检测方法的建立为单面针的药用价值进一步开发利用提供依据和理论指导。

实验结果表明：单面针药材根、茎部均含有白鲜碱，且同一产地根部白鲜碱含量明显高于茎部，马英姿等[16]曾对蚬壳花椒采用组织化学定位方法研究生物碱在植株体内的分布，结果表明根中生物碱含量大于茎中含量，与本研究结果一致；不同产地单面针药材中白鲜碱含量差异较大，可能是因为植物有效成分的积累不仅受植物发育进程的调控，还受水、光照、温度、空气、土壤等多种环境因子的调控[17-18]；与野生资源相比，人工栽培的单面针药材中白鲜碱含量较低，但在根、茎部分布较均匀，这种现象究竟是由特定的环境因子和气候特征引起的还是在单面针人工快繁的某些环节发生了变化？何种机理尚需进一步的深入研究。

本实验仅对湖南张家界、湖北恩施和贵州铜仁及人工栽培于长沙的单面针白鲜碱含量进行测定分析，未对其他产地的单面针中白鲜碱及其他有效成分的含量进行研究，具有一定的局限性。还有待于对单面针药材的不同生长年限、采收时节等更多的代表性的样品进行分类测定，开展单面针药材中多指标成分的定量测定和指纹图谱的定性测定，以期为单面针药材的有效成分提供更为全面的信息，进而使单面针药材的质量评价方法更为完善。

[1] 中国科学院植物研究所. 中国高等植物科属检索表[M]. 北京：科学出版社, 1979.

[2] 王 平, 王海霞, 马英姿, 等. 蚬壳花椒叶片不定芽诱导与内源激素的变化规律[J].中草药, 2008, 39(9): 1400-1403.

[3] 马英姿, 王 平, 袁 园, 等. 蚬壳花椒中性亲脂性成分的抑菌活性及其化学成分[J]. 2010, 林业科学, 46(2): 162-165.

[4] 汤 俊, 朱 卫, 屠治本. 蚬壳花椒化学成分的研究[J]. 中草药, 1995, 26(11): 563-565.

[5] Tang Jun, Supinya T, Wang Zhengtao, et al. Aurantiamide Acetate from stems of Zanthoxylum dissitum Hemsley[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2003, 12(4): 231

[6] 刘 韶, 章 伟, 何桂霞, 等. 单面针茎化学成分的研究[J].中国中药杂志, 2009, 34(5): 571-573.

[7] El Sayed K, Al-Said MS, El-Feraly FS, et al. New quinoline alkaloids from Ruta chalepensis[J]. Nat Prod, 2000, 63(7): 995-997.

[8] 姜林锟, 杨 松, 王志东, 等. 白鲜碱及其衍生物的研究进展[J]. 广州化工, 2009, 7(5): 32-38.

[9] Liu Z L, Xu YJ, Wu J, et al. Feeding deterrents from Dictamnus dasycarpus Turcz against two stored-product insects[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(6): 1447-1450

[10] 朱丹妮, 徐 强, 邱南生. 白鲜皮中白鲜碱含量测定[J]. 植物资源与环境, 1998, 7(2): 61-62.

[11] 郭守军, 杨永利, 佘建保, 等. 高效液相色谱法分析猪屎豆种子胶多糖中的单糖组成 [J].广西植物, 2010, 30(3): 422-425.

[12] 黄海滨, 苏 健, 谭叶憧. HPLC法测定黎豆中左旋多巴的含量[J]. 广西植物, 2004, 4(5): 460-462.

[13] 李艳园, 彭如习, 陈 桦, 等. HPLC法测定白鲜皮中白鲜碱的含量[J]. 中药材, 2006, 9(8): 802-803.

[14] 王 森, 朱卫丰, 欧水平, 等. 促透剂对良肤乳膏中丹皮酚、白鲜碱、梣酮和甘草次酸的体外透皮吸收及皮肤滞留量的影响[J]. 中国中药杂志, 2009, 34 (14): 1778-1782.

[15] 黄端华, 童 萍,何聿,L刘薇,张兰.毛细管电泳用于中药白鲜皮中生物碱的分析[J]. 分析测试技术与仪器,2011,17(1):23-28.

[16] 马英姿,胡忠红,杨波华,等.蚬壳花椒营养器官解剖结构及其生物碱分布[J]. 湖南农业大学学报:自然科学版,2009,35(3): 242-244.

[17] 林启寿. 中草药成分化学[M]. 北京: 科学出版社, 1997．

[18] 马英姿, 王 平, 张 慧, 等. 酸碱胁迫对药用植物蚬壳花椒白藓碱含量的影响[J]. 中南林业科技大学学报, 2011,31(9):100-104.

Quantitative determination of dictamnine in Zanthoxylum dissitum Hemsl by using HPLC

WANG Li-mei, WANG Ping, SUN Ji-kang, CHENG Peng, FEI Ming-liang
(School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

An analysis method using high performance liquid chromatographic for determining dictamnine in Zanthoxylum dissitum Hemsl had been successfully established. In the experiments, dictamnine was obtained by ultrasonic extraction and separated on SinoChrom ODS-BP C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) and the mobile phase was mixture liquid of acetonitrile and 0.01 mol/L NaH2PO3(50︰50, V/V); the flowing speed of the mobile phase was 0.8 mL/min, and the wavelength for detecting dictamnine was 236 nm. The results indicate that when the injection volume of the dictamnine ranged from 0.0015 to 0.200 0 μg, a significant linear relationship showed between the peak area and the mass concentration (R2=0.9995), the average recovery rate of dictamnine was 98.8%,and the relative standard deviation (RSD) was 3.06% (n=6). In conclusion, the established analysis method possessed good accuracy,reliability and high repeatability, which made it a suitable detection method for determining dictamnine in Z. dissitum from different origin place and medicinal parts.

Zanthoxylum dissitum; dictamnine; HPLC; determination of content

S727.34

A

1673-923X(2013)06-0075-04

2013-01-18

国家林业公益性行业科研专项（201204606）；高等学校博士学科点专项科研基金（200943921110002）

王丽美（1987-），女，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物

王 平（1964-），男，湖南常德人，教授，博士，博士生导师，主要从事生态学领域方面的研究；E-mail：csfuwp@163.com

[本文编校：吴 彬]