陈学泽，甘正伟

(中南林业科技大学 理学院，湖南 长沙 410004)

用大孔吸附树脂分离纯化香薷总黄酮

陈学泽，甘正伟

(中南林业科技大学 理学院，湖南 长沙 410004)

以湖南香薷为原料，选择最佳大孔吸附树脂对其总黄酮进行分离纯化。实验分别采用了静态实验和动态实验对总黄酮收率、纯度等指标进行考察，综合评定。结果表明，D301型大孔吸附树脂为纯化香薷总黄酮的最佳树脂，静态饱和吸附量为104.72 mg·g-1，洗脱液为乙醇浓度为70%，提取液的pH为4或5，洗脱温度为30 ℃。静态吸附在120 min时达到平衡。动态吸附-洗脱实验表明，最佳工艺参数为：杂质用水量为4 VB；洗脱剂为70%乙醇，其用量为4 VB。总黄酮回收率和纯度均在80%以上。

香薷；总黄酮；分离；纯化

大孔吸附树脂是近三十年来才发展起来的一类有机高聚物吸附剂[1-2]，它不溶于酸、碱及各种有机溶剂。1970年代末开始将其应用于中草药成分的提取分离。该技术是继离子交换树脂后的分离新技术之一。

香薷为唇形科植物,根据理化性质和光谱数据鉴定结构 ,主要有效成分为:黄芩素-7-甲醚(negletein，Ⅰ)、槲皮素( quercetin，Ⅲ)、金圣草黄素( chrysoeri2ol, Ⅳ)、木犀草素( luteolin，Ⅱ)和芹菜素(apigenin，Ⅴ)[3]。黄酮类物质具有抗防衰老、抗菌、抗癌等功能，因而被广泛研究[4-6]。笔者尚未见香薷总黄酮的分离纯化报道。实验对D301等5种大孔吸附树脂进行筛选，并对香薷总黄酮分离纯化进行深入探索。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

香薷全草(产自湖南)，Na(NO2)(分析纯)，NaOH(分析纯)，Al(NO3)3(分析纯)，大孔吸附树脂 AB-8、D301、HFD-300、NKA-9和 S-8型， 无水乙醇等。

1.2 主要设备

紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，电子天平(PB203-N)，恒温水浴锅，搅拌器，抽水泵，移液管，玻璃杯等。

1.3 实验方法

1.3.1 香薷黄酮化合物的提取方法

香薷干燥全草粉碎过筛，用70%的乙醇在70℃恒温水浴中搅拌回流1 h，后采用布氏漏斗抽滤，得到香薷乙醇的提取液，最后将提取液浓缩浓度至 5.25 mg·mL-1,以备使用。

1.3.2 芦丁标准曲线的制作

以芦丁为标准品，配制一系列不同浓度的溶液，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，测定OD510值，用最小二乘法作线性回归，得到标准曲线方程式：c=1.036 0A-0.001 51，R=0.997 4。

1.3.3 大孔树脂的筛选[7-8]

分别称取一定量的AB-8型、D301型、HFD-300型、S-8型、NKA-9型树脂，置入4～5 BV的95%乙醇中浸洗，24 h后加入适量的蒸馏水，如仍有白色浑浊现象，反复浸洗，至无白色浑浊现象后用蒸馏水反复洗涤，至上液体澄清无味。用4 BV的2 mol·L-1NaOH浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性，再加入4 BV的3.3 mol·L-1HCL浸泡12 h，再用蒸馏水洗至中性。等自然干燥后，分别准确称取各型树脂1 g，分别转入50 mL三角烧瓶中，加入20 mL的香薷黄酮提取液, 在常温下置于振荡器上间隔振荡2 h,后静置20 h,使其达到饱和吸附。吸取上层清液测定OD510值，计算总黄酮浓度和饱和吸附量：

饱和吸附量=[(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积]/树脂量(mg·g-1干树脂)。

1.3.4 乙醇体积分数对洗脱率的影响

准确称取D301干树脂7份(1 g)，分别转入50 mL三角烧瓶，加入20 mL的黄酮提取液，在常温下置于振荡器上间隔振荡2 h,静置20 h, 使其达到饱和吸附，分离出饱和树脂，再用吹风机吹吸干其表面，分别转入干净的50 mL三角烧瓶，加入体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇20 m:，再置于电动振动器上间隔振荡2 h，测定OD510值，计算洗脱液浓度和洗脱率：

洗脱率=[洗脱液浓度×洗脱液体积]/饱和吸

附量×100%)。

1.3.5 pH对D301型树脂对香薷总黄酮静态吸附的影响

准确称取D301干树脂各8份(1 g)，分别转入50 mL三角烧瓶，加入pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10的提取液20 mL, 在常温下置于振荡器上间隔振荡2 h,静置20 h,使其吸附饱和，吸取上层清液，测定OD510值，计算溶液浓度和吸附量。

1.3.6 吸附温度对D301树脂吸附香薷总黄酮静态吸附的影响

准确称取处理好的D301干树脂各5份(1 g)，分别转入50 m:三角烧瓶，加入20 mL的提取液,分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃温度下间隔振荡2 h,后静置20 h,使其吸附饱和，再吸取上层清液，测定OD510值，计算溶液浓度和吸附量。

1.3.7 静态吸附时间对D301树脂吸附香薷总黄酮的影响

准确称取D301干树脂9份(1 g)，分别转入50 mL三角烧瓶，再加入20 mL的提取液, 在常温下置于振荡器上间隔振荡，分别于20、40、60、80、100、120 min时吸取上层清液，测定OD510值，计算溶液浓度和吸附量。

1.3.8 动态吸附-洗脱性能研究

分别称取已处理好的D301型干树脂100 g和20 g湿法装入2.5 cm×30 cm色谱柱中，香薷提取液400 m:(5.25 mg·ml-1)以每小时2 BV的流速上柱，用蒸馏水以3～5 mL· min-1速度洗涤至无色，再以2 BV的70%乙醇以3 mL·min-1的洗脱速度洗脱，测定总黄酮浓度，再将其减压浓缩，干燥，称重。计算吸附-洗脱相关数据。

1.3.9 冲洗杂质用水量对D301树脂动态吸附香薷总黄酮的影响

准确称取已经预先处理的D301干树脂10 g,采用湿法装入1.5 cm×20 cm的色谱柱中，以浓度为5.25 mg·mL-1的香薷提取液60 mL ,以大约2 BV·h-1的流速上柱 ,过完柱子后 ,分别以2、4、6 BV蒸馏水过柱冲洗，其流速在3～5 mL·min-1之间，之后用4 BV的70%乙醇以3 mL·min-1速度进行洗脱，收集洗脱液,测其吸光度,计算出相关数据。

1.3.10 洗脱剂用量对D301树脂动态吸附香薷总黄酮的影响。

准确称取已经处理好的D301吸附树脂10 g ,装入1.5 cm×20 cm的层析柱中 ,湿法装入香薷提取物水溶液 60 mL ,以大约2 BV·h-1流速上柱 ,以4 BV蒸馏水洗完全后 ,分别以2、4、6 BV的70%的乙醇洗脱，收集洗脱液,测其吸光度,计算出相关数据。

2 结果与分析

2.1 树脂筛选结果

不同吸附树脂对香薷总黄酮的静态吸附量，结果如表所示：

表1 五种吸附树脂静态吸附量测定结果Table 1 The static adsorption capacity of five types of macroreticular adsorbents

从表可知，5种吸附树脂对香薷总黄酮的静态吸附量在100 mg左右，其中D301型最高，表现出最佳的综合性能。

2.2 乙醇浓度对洗脱率的影响

表2表明,洗脱率随乙醇浓度增大而增大，当乙醇体积达到70%～90%时，洗脱率变化不明显。考虑到节约成本及生产安全上的方便,实验采用70%乙醇为洗脱剂最适宜。

表2 乙醇浓度对D301型树脂的洗脱率的影响Table 2 Effects of ethanol concentrations on elution rate of D301 resin

2.3 pH对D301吸附量的影响

表3表明:上样液的pH 4～5时吸附效果最好。这主要是因为黄酮类化合物具有酚羟基，偏显弱酸性，当pH过大时，黄酮化合物具有离子化趋向，从而不易被吸附，因此上样液pH选择4～5最合适。

表3 pH对D301饱和吸附量的影响Table 3 Effects of pH on saturated adsorption capacity of D301 resin

2.4 温度对D301饱和吸附量的影响

表4表明：吸附温度对D301饱和吸附量的影响不大，对香薷总黄酮的吸附都在100 mg以上，考虑到能量损耗和实验方便，本实验选温为30 ℃为宜。

表4 温度对D301饱和吸附量的影响Table 4 Effects of temperature on saturated adsorption capacity of D301 resin

2.5 静态吸附时间对D301树脂对吸附量的影响

由图1可知，D301型吸附树脂对香薷总黄酮化合物的静态吸附在120 min左右达到平衡。

图1 吸附时间对D301树脂吸附量的影响Fig. 1 Effect of adsorption time on amount of amount of D301 resin

2.6 动态饱和吸附-洗脱性能的研究

D301型树脂动态饱和吸附-洗脱的实验结果见表5。

2.7 冲洗杂质用水量对D301树脂动态吸附-洗脱影响实验结果

冲洗杂质用水量对D301型树脂对总黄酮收率的影响并不明显(见表6),总黄酮纯度变化不大。为了缩短洗脱时间,节约洗脱用水，选择4 BV的蒸馏水洗脱用量最适宜。

表5 D301型树脂动态饱和吸附-洗脱实验结果Table 5 Dynamic adsorption-elution capacity by D301 type macroreticular adsorbent

表6 冲洗杂质用水量对D301树脂动态吸附香薷总黄酮的影响Table 6 Effects of water amount used in impurities washing on total flavone in Chinese Mosla Herb by D301 resin dynamic absorption

2.8 洗脱剂用量对D301树脂动态吸附-洗脱影响的实验结果

洗脱剂用量对D301型树脂对总黄酮收率和纯度的影响均不明显(见表7),考虑到洗脱剂用量过多增加了洗脱时间，会造成浪费,也延长生产周期,故以4 BV 的70 %乙醇洗脱最合适。

表7 洗脱剂用量对D301树脂动态吸附香薷总黄酮的影响Table 7 Effects of amount of eluent on amount of total flavone in Chinese Mosla Herb by D301 resin dynamic absorption

3 结论与讨论

(1)实验表明，D301型大孔吸附树脂是分离纯化香薷总黄酮的优良树脂，其静态吸附量达到104.72 mg·g-1；该树脂吸附性能良好，容易解吸附，有较好的综合分离纯化能力。

(2)静态实验和动态实验中，D301型树脂对香薷总黄酮收率、纯度等指标的考察表明：乙醇体积分数达到70%时，洗脱率上升趋势平缓。由于乙醇浓度高易挥发，选用70%的体积分数即可。提取液的pH 4～5时，饱和吸附量最大，说明提取液的pH值平偏酸性有利于树脂吸附。提取温度对静态吸附的影响不明显，因此实验选温在30 ℃为宜。D301型树脂对总黄酮的静态吸附在120 min左右已达到平衡。

(3) 通过动态吸附-洗脱试验的研究，发现冲洗杂质用水量对D301型树脂对总黄酮收率和总黄酮纯度影响不大，洗脱剂用量对D301型树脂对总黄酮收率和纯度的影响也不明显,从节约用料用水和生产周期考虑, 以4 BV的蒸馏水洗脱，以4 BV的70%乙醇洗脱最合适。

[1] 马振山.大孔吸附树脂在药学领域中的研究应用[J].中成药,1997,19(12):40-41.

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Separation and purification of total flavonoids by macroporous adsorption resin from Chinese Mosla Herb

CHEN Xue-ze, GAN Zheng-wei
(School of Sciences, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004,Hunan,China)

To establish a technical process for the separation and purification of total flavones from Chinese Mosla Herb, the total flavone in Chinese Mosla Herb were separated and purified by macroporous adsorption resin. The purity and yield of flavonoids were eхamined by static and dynamic eхperiments. The results show that D301type resin was the best resin for separating and purifying flavonoids from Chinese Mosla Herb. The static saturated adsorption capacity was 104.72 mg·g-1, the eluant was 70% alcohol, the pH value of the sample was 4～ 5， the temperature was 30 ℃ , Static adsorption reached a balance in about 120 minutes. The dynamic adsorption-dissolve eхperiments indicated the optimum conditions were as follows: the volume of the water was 4VB, the volume of 70% of ethanol was 4VB. The recovery and the purity of flavonoids were both more than 80%.

Chinese Mosla Herb(Elsholtzia haichowensis)；total flavonoids; separation；purification

S789.2

A

1673-923(2012)02-0105-04

2011-09-12

陈学泽(1954 —)，男，湖南永州人，教授，博士，主要从事天然有机物的分离和分析方法的研究；E-mail：chenхueze2003@163.com ；甘正伟(1985—)，男，硕士研究生；E-mail：zhenli1985@126.com

[本文编校：文凤鸣]