杨 峰 ，李志辉 ，蒋 燚 ,2，杨模华

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.广西林业科学研究院，广西 南宁 530001）

红锥优良家系ISSR遗传多样性分析

杨 峰1，李志辉1，蒋 燚1,2，杨模华1

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.广西林业科学研究院，广西 南宁 530001）

利用ISSR分子标记技术，对来自广西的32个红锥Castanopsis hystrix家系进行遗传多样性分析。从广西大青山实验林场红锥种质资源圃中选出32个优良家系，通过每木检尺等方法挑选出2～3株优良单株进行样品采集。从100对常用引物中筛选出的11个引物进行遗传多样性分析共扩增得到168个多态位点。结果得出：在大青山实验林场采集的90个样品总的多态位点率高达到100%，总的 Shannon信息指数（I）为0.550，Nei，s基因多样性指数（h）为0.3697。这表明样品的遗传多样性较高，个体差异大，聚类分析可以将32个家系分为三类。

优良家系；分子标记；ISSR；红锥；遗传多样性；聚类分析

红锥Castanopsis hystrix Miq又叫刺栲，栲树（浙江平阳），小红栗栲，红栲，红锥栗，红锥栲等，是壳斗科 Fagaceae栲属Castanopsis (D. Don) Spach常绿乔木[1]，分布于福建南部、湖南南部、广东、广西、贵州西南部、西藏东南部墨脱等地区[2]。红锥以其生长快速，适应广泛，效益较高等特点深受人们的喜爱。果实富含淀粉、蛋白质、脂肪、B族维生素等多种营养素，可作食物、酿酒；树皮、种子壳内含有单宁等物质，可制取栲胶；红锥萌发力强，枝条生长迅速，枝繁叶茂，耐荫蔽性较好，可混交也可纯林种植，是松、杉混交造林较合理的伴生树种之一[3]。但是由于土壤、气候、温度等一系列立地条件的不同和多样性，红锥广泛的分布形成了不同种源间的差异，再加上长期的人为干扰，使得红锥的遗传变异变得十分丰富。想要提高红锥单株立木的材积就必须选择优良品种进行栽培，传统选育耗时耗力，所以选择分子选育加快选育的进程，缩短选育的时间。近几十年来，我国在大力提倡发展优良珍贵乡土阔叶树种，而红锥优良特性的研究及开发应用得到了科研和生产部门的重视。营造红锥人工林需要大量的健壮的苗木和优质种子，为了能详细地了解红锥的进化过程、保护树种基因的多样性及制定合理的选育策略，对红锥野生或人工林优良植株的遗传多样性进行分析、分类、鉴定和良种选择是很有必要的。

目前关于红锥大多还是处于栽培、培育等方向上的研究，在DNA分子水平上研究的不是太多。因此本实验采用ISSR方法进行研究。ISSR（inter simple sequence repeat），简单重复序列区间分子标记技术[4]，是以重复序列的单一引物为主要引物序列的PCR标记，它利用包含重复序列并在3’或5’端锚定单寡聚核苷酸的引物对基因组DNA进行PCR扩增的标记系统[5-8]。它的引物比RADP的要长，退火温度更高，因此具有更高的重复性和稳定性[9-11]。比RFLP、SSR等多态性更高，已广泛应用于品种选育和鉴定中了。

利用ISSR标记对5个不同种源的32个红锥家系进行遗传多样性分析，主要是在合理利用与保护开发红锥资源和选育优良品种等方面提供理论依据，对探讨其遗传关系，构建红锥指纹图谱提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料选用2002年4月种植于中国林科院热林中心伏波分场的32个红锥家系，家系分别来自于浦北、博白、凭祥、东兰和容县，采集了种源在浦北的8个家系，博白和容县各采了7个家系，凭祥、东兰各5个，每个家系采集2～3个样，样品数共90个，采样时进行每木检尺，记录胸径、树高、冠幅等，再从家系测定的数据中，选择综合数据优良植株进行采样，采取叶片作为实验对象。

1.2 实验方法

采用改良CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵) 法[12]来提取DNA， DNA质量用0.7%琼脂糖凝胶电泳来测，用紫外吸收法测定DNA的纯度和浓度。将样品稀释至15 ng/μL，置于-24℃冰箱中保存备用。

筛选引物，从哥伦比亚大学公布的UBC800-UBC900的100条引物（由上海英骏生物技术公司合成）中选取11条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物，对90个红锥DNA样品进行ISSR分析。

扩增反应运用美国的ABI公司生产的PCR扩增仪进行反应，总体积是20 μL的ISSR-PCR反应。 包 括 2.0 μL 10×buffer ，0.3 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物，1.4 μL 2 mmol/L Mg2+， 0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，30 ng的DNA模板。PCR最优程序是：先将样品进行94℃预变性5 min后，再开始PCR扩增循环，每个循环要进行94℃变性30 s，52 ℃～58 ℃变性45 s，72℃延伸2 min，要进行40个循环，最后一个循环结束后在72℃延伸7 min，最后4℃保存。对扩增产物用1.4%的琼脂糖凝胶进行电泳，1×TBE的电泳液，用Bio-Rad凝胶成像分析系统拍照保存[13]。

1.3 数据处理与统计分析

我们将电泳图谱的每条DNA片段，都分别记做一个分子标记（marker），用以代表一个引物的结合位点。在根据各个分子标记的迁移率和有无，对扩增条带进行赋值，将有扩增条带的赋值为“1”，无扩增条带的赋值为“0”，在Excel表格中形成“01”二元数据矩阵。根据实验材料所统计的数据，利用POPGEN32软件进行分析。

2 结果分析

2.1 红锥ISSR引物选择和扩增结果

利用ISSR分子标记，以2个最优单株和一个较差植株的DNA样品为模板，从100条ISSR引物中筛选出11条较稳定、多态性丰富、重复性好的引物，对90个红锥DNA样品进行PCR扩增，扩增结果见图1，共扩增出168条带（从250 bp～2 300 bp）其引物编号和序列见表1。

图1 引物808对红锥群体进行ISSR-PCR扩增的电泳Fig.1 The electrophoresis of ISSR-PCR amplification for primer 808

2.2 红锥种源家系聚类分析

生物个体的全部遗传组成称为基因型，而DNA就是基因型的决定者，它含有整套的遗传信息，个体与个体之间的DNA是有差别的，这就导致个体之间表现型的千差万别。环境和气候对基因型的选择也有一定的影响，这种作用是缓慢的持续的，必须经过很长时间才能引起基因的改变。

从图2系统树中，可以看出在分为3支，即浦北和博白种源群体，容县和凭祥种源群体及东兰种源群。凭祥和容县在地理位置上相距很远，但是在红锥的生长环境上却极为相似，有一致的温度和降雨量（温度是21.8℃，年降雨量1 476.1 mm），相似的土质和气候，这可能是两者遗传距离接近的原因，又因为参试凭祥种源是80年代在凭祥种植的人工林，原种子来源为玉林地区（含容县、博白），可能也是两者遗传距离接近的原因之一。容县、浦北和博白的地理位置相近，导致三者的遗传距离较为接近。东兰不管是气候还是位置都与其他四个地方相差很大，所以遗传距离最远。

表1 红锥ISSR引物编号及序列Table 1 UBC number of Castanopsis hytrix ISSR primer and their sequences

图2 五大种源区聚类分析Fig.2 Cluster analysis on five seed source areas

根据对32个家系的聚类分析发现（图3），各种源区均有小部分部分家系聚合在一起，这表明各家系间的遗传距离较近，容县家系聚合较紧密，表明该家系遗传相似度很高，浦北和博白在地域性聚类不明显，可能是由于两地相距较近，基因交换较频繁使得两地遗传距离较近，东兰家系在图3上的表现出与其他四个家系的遗传距离较远，进一步证实了环境的差异也是改变遗传的一个重要原因，又依据其它种源收集的地理位置的不同，分析出地理环境的影响是普遍存在的，尤其在基因型方面。而基因型是适应环境的结果，是形成不同的家系或地理种源区主要原因之一，正由于基因的差异才让我们区别不同种源区的个体成为可能，尤其是在使用分子分析方法上比比较表型分析更加准确。

图3 32个家系聚类分析Fig.3 Cluster analysis on 32 superior genealogy

通过对群体数据遗传多样性分析，发现广西红锥的总多态位点数为168，总多态位点百分比（P）达到99.83%，总Shannon信息指数（I）为0.550，总的Nei's基因多样性（h）为0.3697都显示出广西红锥都具有极高的遗传多样性。

相较于王蕾等对红锥10个不同种源的研究（多态位点百分比74.7%），多态位点百分比高出25.3%，也就是有效多态性条带更多了。这就说明选择优良的家系对提高遗传多样性是有影响的。对群体多态性位点百分比的分析发现（表2），大青山实验林场红锥优良家系的总群体基因多样性（Ht）是0.3382，基因分化系数（Gst）为0.0546，群体内的变异达到了94.54%，说明红锥的主要变异是存在于种群内部的。

表 2 不同群体遗传多样性分析Table 2 Genetic analysis of Castanopsis hystrix in different populations

3 讨 论

采用ISSR分子标记对大青山实验林场的红锥进行遗传多样性的研究分析，归纳为以下几点：

(1)通过PopGen32和PAUP4.0软件对红锥进行群体和个体分析，得出大青山实验林场红锥的遗传多样性程度丰富。从各个指标来看，多态位点百分率（100%），Shannon信息指数（0.550）和Nei’s基因多样性（0.3697）等可表明这些样品具有较高的遗传多样性水平。但是在各家系之间还是存在着差异，博白表现最好，它的多态性位点百分比是99.40%，说明其遗传多样性最丰富，对环境的适应力最强。

(2) ISSR分子标记技术的原理和操作与RAPD、SSR等相似，但与其相比ISSR不需要提前知道基因组序列，更减少了多态性分析的预备工作[14]。引物的长度一般在15～24 bp，退火温度在52 ℃～58℃，远高于RAPD的退火温度，所以ISSR对PCR反应的敏感程度明显低于RAPD；ISSR引物中含有一定长度的简单重复序列，在复制过程中存在滑动和不均等交换，这使得在不同品种或群体及个体之间的重复次数存在很大差异，且更容易使引物结合位点和结合位点的片段长度产生差异[15]，而产物多态性远比SSR、RFLP、RAPD丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，而且实验稳定性高，重复性好，操作简单、检测结果方便，有着很好的发展前景。

(3)广西地处中国的西南部，地理差别极大，地区的地形趋势是由西北向东南倾斜，其中包含有盆地、溶岩、丘陵、台地等地形相互交错分布。气候主要受季风环流和太阳辐射的影响。在地域上说，广西是云贵高原向东南沿海的过渡地带，使得广西形成了复杂多变地貌类型。为红锥基因型在地理上的分离和变异提供了有利条件。东兰地处云贵高原南端，土壤属亚热带阔叶林红壤地带，土壤母质是由钙质页岩、石灰岩等构成，相较于凭祥等的地理地貌有较大的区别。凭祥在南宁西南方向，位于东经 106°41′～ 106°59′；北纬21°57′～ 22°16′，地处中越交界，与越南凉山省毗邻。土地肥沃，雨量充沛，平均日照达1 614 h，是典型的亚热带季风性气候，浦北、博白、容县与凭祥纬度相近，有类似的气候，可能是造成遗传距离相近原因。而东兰由于土壤和气候的差异，有较远的远的遗传距离是很有可能的。

(4)群体的起源和生活型是决定群体遗传变异和分化的主要因子，生存环境起到很大一部分作用。地理分布和立地条件的差异也是影响。因此，想要了解遗传多样性的影响因子就要对其大部分影响因子进行评价和分析，这样才能正确评价遗传多样性。

4 结 论

红锥优良性状的保持和遗传多样性的保护将是我们对红锥研究的主要目的和任务。红锥良种优树的选育和选择，提高优质树木的产量，加快良种优树的培育进程，提高遗传多样性都是我们进一步研究的目标。依本研究所得数据来看，优良家系的选择已初见成效，但目前仍然存在着红锥遗传多样性的损失，这不仅降低其群体对自然环境的适应，同时还会对经济和社会环境产生影响。有鉴于此，对红锥的优良家系选择、评估红锥遗传多样性水平是很有必要的。

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Genetic diversity of Castanopsis hystrix superior genealogy by ISSR marker

YANG Feng1, LI Zhi-hui1, JIANG Yi1,2, YANG Mo-hua1
(1.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2.Guangxi Forestry Science Research Institute, Nanning 530001, Guangxi, China)

∶ Genetic diversity of superior genealogy of Castanopsis hystrix from thirty two different ecological regions was analyzed by using the inter-simple sequence repeat（ISSR）. Select 32 superior genealogy from Daqingshan Test Forestry Farm in Guangxi province and we exploited log scaling choose 2～3 trees of excellent quality to collect sampling. We finded 11 effective primers were selected from 100 primers.We amplified 168 bands and them were polymorphic. The result showed asflollows：percentage of polymorphic bands were 100% which 90 samples were supplied by Daqingshan Test Foresty Farm，and the Shannon information index（I） was 0.550 and Nei，s gene diversity index （h）0.3697. These results indicated that Daqingshan Test Foresty Farm to supplied those samples of Castanopsis hystrix had high levels of genetic diversity and great individual variations.These thirty two superior genealogy were divided into three groups by cluster analysis.

∶ superior genealogy; molecular marker; ISSR; Castanopsis hystrix; genetic diversity; cluster analysis

S718.155

A

1673-923X(2012)07-0123-05

2012-04-25

国家“十一五”广西林业科技项目“广西主要优良乡土树种—红锥良种选育与示范”（桂林科字[2009]2—1号），广西科学研究与技术开发计划项目“红锥良种选育与丰产栽培模式研究”（桂科攻10100012—3）

杨 峰（1986—），男，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：林木定向培育

蒋 燚（1968—），男，广西人，高级工程师，博士研究生，研究方向：森林培育

[本文编校：吴 彬]