张 莉，苏曼琳

(1.山西农业大学 农学院, 山西 太谷 030801；2.北京林业大学 林学院，北京 100083)

植物抗旱基因HDCS1的克隆和表达载体的构建

张 莉1，苏曼琳2

(1.山西农业大学 农学院, 山西 太谷 030801；2.北京林业大学 林学院，北京 100083)

以二棱大麦幼苗Hordeum distichon Linn.中提取的总RNA为模板，通过RT-PCR的方法获得与抗旱相关的转录因子基因，并将此基因片段用PMD-19T载体进行克隆，序列分析得知该目的片段HDCS1长约664 bp，含有一个完整的阅读框，其编码的蛋白质属于LEA蛋白，且HDCS1与Genebank中已报道的同源蛋白编码基因HVA1（FJ026803.1）序列相似性为98.64%。以植物表达载体PBIl21为基础，将HDCS1基因连接于组成型启动子CamV35S和NOS终止子之间，构建植物表达载体PBI121-HDCS1并进行PCR和酶切鉴定，为提高植物抗旱性研究奠定了基础。

植物抗旱基因（HDCS1）；基因克隆；表达载体

干旱是影响植物正常生长发育的一个最重要的逆境因子，有关植物抗旱性能以及植物与干旱胁迫之间关系的研究一直受到人们的关注[1-2]。随着现代分子生物学与生物技术的发展，人们已经能够从分子水平上研究植物抗旱性能的机制。干旱胁迫会引起植物细胞脱水，从而诱导植物体内多种抗性基因的表达。植物的抗旱性是一个复杂的多基因控制系统[3-5]，抗旱的转录因子可以调控一系列抗旱相关基因的表达，是一种十分有效的提高耐旱性的途径。目前，已有研究从各种植物中发现和鉴定了几十种与抗旱性相关的功能基因[6]。将这些基因转入植物，对抗旱性都有了不同程度的提高。这些抗旱相关功能基因的发现，为人们通过抗旱基因工程改良植物的抗旱性开辟了新的途径。

HDCS1基因最早是从二棱大麦中发现的抗旱基因，它与大麦中的一个抗旱基因HVA1具有高度的同源性[7]，但是关于它的系统研究还未见报道。本研究在此背景下，选择对抗旱基因HDCS1进行克隆，并构建了HDCS1的植物表达载体，为进一步利用抗旱基因HDCS1的优异性能及价值并为下一步进行该抗旱基因的转化提供了前提条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

二棱大麦Hordeum distichon Linn.，种子先用自来水浸泡12 h，发芽后备用；

1.1.2 菌株和质粒

大肠杆菌菌株DH5α，质粒PBIl21载体及载体PMD-l9T均购自大连TaKaRa生物工程有限公司。

1.1.3 酶及主要试剂

DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶；RNA抽提试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒、小量琼脂糖凝胶回收试剂盒、酵母质粒小量提取试剂盒，均购自大连TaKaRa生物工程有限公司；DMSO等其他常规生化试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 二棱大麦的培养

二棱大麦的种子先用水浸泡12 h，然后用0.1 mmol/L的ABA浇灌幼苗，生长24 h后用DEPC水反复冲洗，然后用灭菌滤纸吸去表面水滴，称取0.8 g茎叶组织备用；

1.2.2 RNA的提取和cDNA的克隆

采用Trizol试剂盒从二棱大麦的茎叶组织中提取总RNA，然后用反转录试剂盒合成cDNA第一条链。根据HVA1cDNA序列合成一对引物：

P1上游引物：5’-CGTGAGACGAAGATGG CCTCCAACC-3’

P2下游引物：5’-AAACACGACTAAAGGA ACGG-3’

通过随机引物反转录合成cDNA第一链后，建立如下体系进行PCR反应：

200 μL EP 管中分别加入 2.5 μL cDNA 第一模板链、5 μL dNTPs、2.5 μL 反应缓冲液、2 μL DMSO、各1 μL的上、下游引物（15 pmol），最后加入加ddH2O使反应液总体积为25 μL；

进行PCR反应时的程序设定如下：先95℃变形10 min，加入1 μL Taq DNA聚合酶，然后按94℃ 1 min、55℃ 53℃各 40 s、72℃延伸 90 s，共进行35次循环。所得的PCR扩增产物经电泳和紫外分析鉴定后，用小量琼脂糖凝胶回收试剂盒回收所需目的片段。

1.2.3 反转录产物的克隆与测序分析

反转录产物经琼脂糖凝胶电泳分离并回收后，HDCS1基因片断首先在T4连接酶的作用下与载体PMDTM-l9T连接，然后将该连接产物转化已经准备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过蓝白斑筛选后，用PCR的方法筛选以获得阳性克隆，经鉴定后命名阳性克隆重组子为PMD-HDCS1，由上海生工工程有限公司测序。

1.2.4 植物表达载体PBI121-HDCS1的构建

1.2.4.1 目的片段的修饰

将 2 μL 重 组 克 隆 质 粒 PMD-HDCS1、2 μL Multi-core buffer、1 μL NcoI 和 15 μL ddH2O 组成的反应体系于37℃温浴1 h；经电泳检查消化完全后，加入 1 μL dNTPs、1 μL 大肠杆菌聚合酶ⅠKlenow片段，37℃温浴20 min后再于75℃水浴10 min；降至室温后加入1 μL SacⅠ,37℃温浴1 h。采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

1.2.4.2 PBI 121 的酶切处理

取 2 μg PBI121、2 μL Multi-core buffer和 1 μL SamI 混匀后于25℃温浴70 min，经电泳检测酶切完全后加入1 μL SacⅠ，37℃温浴1 h。采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

1.2.4.3 植物表达载体的构建和检测

将以上2种处理好的回收产物在T4连接酶作用下进行连接并用连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后用40 mg/L 卡那霉素的LB平板培养筛选单菌落。挑选转化后形成的单菌落，用小量提取试剂盒小量提取质粒，用BarnH I和Sac I双酶切方法鉴定阳性克隆，并将最终获得的HDCS1基因的重组子命名为PBI121-HDCS1。

2 结果与分析

2.1 二棱大麦HDCS1基因的cDNA的RT-PCR扩增

提取总RNA之后，经分光光度计和凝胶电泳分析，提取的总RNA纯度较高而且没有发生严重降解。根据大麦相似基因HVA1cDNA序列合成的引物，PCR反应后得到一段长约700 bp的DNA片段，如图1所示。如图1所示。

图1 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 RT-PCR product by agarose gel electrophoresis

2.2 目的基因片段的克隆与测序

RT-PCR产物切胶回收后，将目的片段连接到PMDTM-l9T载体上，以重组质粒PMD-HDCS1为模板，以HDCS1的特异性序列为引物经PCR扩增可得一条长约700 bp的片段，表明PMDHDCS1中存完整的HDCS1片段。经过测序，发现其与Genebank中报道的大麦HVA1基因的cDNA序列同源性为98.64%。

重组质粒PMD-HDCS1酶切鉴定结果如下：

图2 HDCS1序列基因测序结果Fig. 2 HDCS1 gene sequence results by sequencing analysis

2.3 构建植物表达载体PBI121- HDCS1

选择常用的植物表达载体PBI121，首先用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ切除其GUS基因，然后用已获得的HDCS1基因的cDNA片段进行替换，最终构建出一个以CaMV35S启动子调控的HDCS1基因的植物表达载体 PBI121- HDCS1，酶切鉴定如图3。

图3 植物表达载体PBI121- HDCS1的酶切鉴定结果Fig. 3 Identification of PBI121- HDCS1 by restriction enzymes digestion注：其中1，2，3，M分别代表λDNA/HindⅢMarker，PBI121- HDCS1的酶切产物，PCR产物和PCR Marker。

3 讨 论

植物抗旱性属多基因控制的数量性状，通过常规育种方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。借助基因组学和分子生物学技术，发掘、研究和利用植物抗旱相关基因是提高植物抗旱性的有效途径。目前越来越多的研究的关注将相关抗旱基因及通过构建表达载体载入来发挥其抗旱功能。

HDCS1是二棱大麦中编码丰富蛋白（LEA蛋白）的一个基因，而LEA蛋白可以再大麦胚胎发生后期形成脱水保护，因此能够在干旱胁迫时保护生物大分子，因而HDCS1基因的表达可以提高植物的抗旱性能[8-9]。大麦和二棱大麦是同属的近缘植物，他们的LEA编码基因几乎相同。本实验也证实，HDCS1与大麦的LEA蛋白编码基因HVA1的序列同源性为98.64%，有研究表明这种差异是因为HDCS1比HVA1少1个含有11个氨基酸残基的基元序列。也有研究显示，由11个氨基酸构成的基元序列来编码LEA蛋白是一种共性，该基元序列是中性的，成α-螺旋结构，而这也可能是LEA蛋白高级结构的基因基础[8]。本研究克隆了HDCS1基因并构建了其植物表达载体PBI121- HDCS1，为进一步进行抗旱基因的转化奠定了基础，并为相应植物的抗旱基因工程研究提供了参考。

[1] Aharoni A, Dixit S, Jetter R, et a1. The SHINE clade of AP2 domain transcription factors activates wax biosynthesis, alters cuticle properties, and confers drought tolerance when over expressed in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2004, 16: 2463-2480.

[2] 吕 静，刘卫东，王 丽，等. 4种暖季型草坪草的抗旱性分析[J]. 中南林业科技大学学报，2010, 30(3): 100-104.

[3] Huang B, Jin L, Liu J. Molecular cloning and functional characterization of a DREBI/CBF-like gene (GhDREBIL) from cotton [J]. Science in China Series C: Life Sciences, 2007, 50(1):7-14.

[4] 韩 刚，韩恩贤，李凯荣，等. 油菜素内酯对沙棘抗旱生理的影响[J]. 中南林业科技大学学报，2007, 27(3): 5-9.

[5] Agarwal P, Agarwal P K, Nair S, et a1. Stress inducible DREB2A transcription factor from Pennisetum glaucura is a phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA binding activity[J]. Molecular Genetics and Genomics,2007, 277(2): 189-198.

[6] 张永恩，李潮海，王 群，等. 植物抗旱相关功能基因研究进展[J]. 中国农学通报，2004, 20(6): 85-88,113.

[7] 郭卫东，饶景萍，李嘉瑞，等. 二棱大麦LEA cDNA的克隆与测序[J]. 西北农业大学学报，2000, 28(2): 8-12.

[8] Dure L, Crouch M, Harada J, et al. Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants [J].Plant Molecular Biology, 1989, 12: 475-486.

[9] Hong B, Uknes S J, Ho D T. Cloning and characterization of a cDNA encoding a mRNA rapidly induced by ABA in barley aleurone layers [J]. Plant Molecular Biology, 1988, 11: 495-506.

Cloning of plant drought-tolerant gene HDCS1 and construction of its expression vector

ZHANG Li1, SU Man-lin2
(1.College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2. Department of Forestry Science, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

∶ By using the total RNA extracted from the two-rowed barley seedlings Hordeum distichon Linn. as a template, the droughttolerant transcription factor gene was obtained with RT-PCR method. The gene fragments were cloned with the PMD-19T vector.Sequence analysis shows that the target fragment HDCS1 was about 664 bp, containing a complete open reading frame and the encoded protein belongs to the LEA proteins. The sequence similarity between HDCS1 and its homologous gene HVA1 (FJ026803.1,) reported in Genebank was 98.64%. Through plant expression vector PBIl21, HDCS1 genetic was connected between the constitutive promoter of CamV35S and NOS terminator to construct the plant expression carrier PBI121-HDCS1 and PCR, and the restriction endonuclease were used to digest. This study created a laid foundation to improve the drought resistance of plant.

∶ plant drought-tolerant gene (HDCS1); gene cloning; expression vector

S722.3+6

A

1673-923X(2012)06-0115-03

2012-03-22

山西农业大学科技创新基金项目(2011014)

张 莉(1979—)，女，山西襄汾人，博士，讲师，主要研究方向：植物抗旱

[本文编校：吴 彬]