刘纯新，沈英娃，黄星，于丽娜，杨力，聂晶磊，周红

环境保护部化学品登记中心，北京 100012

化学品快速生物降解性是受试物质(有机物)在限定时间内与接种微生物接触，表现出的生物降解能力［1］，是鉴别化学物质的环境危害性和持久性，进行分类和标签［2］，评价和控制环境风险［3］的基本指标。若通过标准方法得到的测试结果表明该受试物质在环境中可被迅速地生物降解，列为“易生物降解”类物质［1］。国际上普遍等效采用经济合作与发展组织(OECD)的六种经典快速生物降解性测试方法［4］。欧盟2008年实施的《关于化学品注册、评估、许可与限制(REACH)法规》和 EC:440/2008法规［5］将这六种方法作为技术法规(相当于我国的强制性国家标准)的C.4部分，要求进口到欧盟成员国的化学品提交这些测试数据。

我国将于2011年12月实施的《危险化学品安全管理条例》［6］，规定了环境保护主管部门负责组织危险化学品的环境危害性鉴定和环境风险程度评估。作为履行该职责的重要技术内容，快速生物降解性数据的科学性、可靠性更加受到各方面的关注。

在国际贸易和环境管理的共同压力下，我国开展化学品、新化学物质快速生物降解性测试的需求增加。一些测试机构和人员由于受专业背景和测试经验的限制，出具的测试数据质量不高。针对审阅测试报告和现场检查发现的问题，结合制订化学品测试标准，对这六种快速生物降解性测试方法进行了比对研究，以期引起同行的关注，促进我国化学品快速生物降解性测试整体水平的提升。

1 我国采用快速生物降解性测试方法的现状

OECD的六种经典快速生物降解性测试方法在其“化学品测试导则”第三部分，具体代号:301A溶解性有机碳(DOC)消减试验，301B二氧化碳(CO2)产生试验，301C改进的MITI试验(Ⅰ)，301D密闭瓶试验，301E改进的OECD筛选试验和301F呼吸计量法试验［7］。

我国2004年实施的HJ/T 153—2004《化学品测试导则》引用了OECD的这六种方法。原国家环境保护总局2003年发布实施、环境保护部2010年修订实施的《新化学物质环境管理办法》以及《新化学物质申报登记指南》要求，在我国申报登记的新化学物质必须提交基于这六种方法的快速生物降解性数据［8-10］。

国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会于2008年将OECD的这六种方法等同转化为六项推荐性国家标准①这六项国家标准与同系列的80项化学品安全测试方法标准一起荣获2010年度国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会联合颁发的“中国标准创新贡献奖”二等奖，编号:2010-84-2-05。，分别为 GB/T 21803—2008《化学品快速生物降解性DOC消减试验》，GB/T 21856—2008《化学品快速生物降解性 二氧化碳产生试验》，GB/T 21802—2008《化学品快速生物降解性 改进的 MITI试验(Ⅰ)》，GB/T 21831—2008《化学品快速生物降解性 密闭瓶法试验》，GB/T 21857—2008《化学品快速生物降解性 改进的OECD筛选试验》和GB/T 21801—2008《化学品快速生物降解性呼吸计量法试验》［11-16］。概述这六种方法技术要点的《化学品快速生物降解性 通则》(国家标准制订计划编号:20081305-T-469)的起草工作已经完成，即将发布实施。OECD于2006年在“301B二氧化碳(CO2)产生试验”基础上推出的新方法“310密闭瓶二氧化碳(顶空试验)法”(该方法的特点将另文论述)［17］，尚未转化为我国标准。

2 经典快速生物降解性测试方法的共同点

2.1 原理

六种测试方法共同的原理是:将含受试物质的无机培养基溶液或悬浮液接种微生物以后，以受试物质作为唯一的有机碳源，在黑暗或散射光条件下好氧培养。通过空白对照组来校正接种微生物内源呼吸引起的误差。试验通常持续28 d，以固定时间间隔测定各参数的变化，计算受试物质快速生物降解率，绘制生物降解曲线［1，7］。如果未到 28 d，生物降解曲线已先达到稳定期(曲线上至少连续3次测定值都保持平稳状态)，可提前结束试验;如果第28天生物降解曲线还未达到稳定期，应延长试验期，但测试结果为阴性，即该物质不具有快速生物降解性。

若试验DOC的去除率达到70%，或生物降解耗氧量达到理论需氧量(ThOD)的60%，或CO2产生量达到理论二氧化碳产生量(ThCO2)的60%，即认为达到快速生物降解的通过水平。28 d内的生物降解率或10 d观察期(观察期窗口从DOC、ThOD的去除率达到10%，或CO2产生量达到ThCO2的10%开始;为减少取样和烧瓶的数量，某些情况可采用14 d观察期)的降解率达到通过水平，可认为受试物具备快速生物降解性;如果在28 d后达到通过水平，则不具备快速生物降解性。

2.2 受试物质必备信息

试验前，必须已知或测得受试物质的溶解度、蒸汽压和吸附性，以此选择最合适的测试方法;若掌握受试物质对细菌的毒性信息，有助于选择合适的试验浓度［18-19］;掌握受试物质的纯度或主要成分的相对比例、化学结构式或分子式，用于计算降解参数的理论值或对测定值进行验证，如理论需氧量(ThOD)、理论二氧化碳产生量(ThCO2)、DOC、总有机碳(TOC)和化学需氧量(COD)。

2.3 参比物质

苯胺(新蒸馏的)、醋酸钠或苯甲酸钠可以作为参比物质，可以选其中一种作为程序对照组和毒性对照组进行平行试验。这三种参比物质在以上六种方法的试验中，均可大部分降解。

2.4 试验用水

为减少对接种微生物的抑制，试验用水必须是高纯度去离子水或蒸馏水，不含对微生物有毒害作用的物质(如Cu2+)。对于每组、每系列试验，必须使用同一批水［1，7］。

3 各测试方法的适用范围

若某受试物质在水中的溶解浓度不低于100 mg/L，而且在水中不易挥发，不被玻璃瓶壁和连接管吸附，这六种方法都适用。对难溶于水(水中溶解浓度＜100 mg/L)、易挥发和易吸附的化学物质，适用的测试方法见表 1［1，7］。

由表1可见，对一般的难溶于水、易挥发、易吸附的化学物质，可以从301C、301D、301F三种方法中选一种进行试验。301A和301E两种方法适用范围有限，不能用于一般的难溶于水、易吸附、易挥发的化学物质测试。虽然对于一些中等挥发性的化学物质，可在保证试验容器密闭、预留足够顶部空间并建立无菌对照组等前提条件下，采用301A和301E方法进行试验，但由于操作复杂，干扰因素多，不如选择其他方法。

表1 六种快速生物降解性测试方法的适用范围Table 1 Applicability of the six test methods

4 六种测试方法的试验要求

4.1 仪器设备和操作要点

六种方法的仪器设备、操作要求见表2［11-16］。

表2 六种快速生物降解性测试方法的仪器设备和操作要求Table 2 Apparatus and technique essentials of the six test methods

4.2 反应容器组数和瓶数

若按接种受试物质组和空白对照组都是两个平行操作计算(即各方法对反应容器数量的最低要求)，301A 的反应容器需要 5 ～8 组烧瓶［11］，301B需要5 ～7 组［12］，301E 需要5 ～8 组［15］，301F 需要5～7组。为确保试验的稳定性和复现性，实际操作中往往采用三个平行。这四种方法都需要增加两组烧瓶。如果在进行301F试验时，要测其中的DOC或受试物质浓度，需要额外再增加一组烧瓶作为吸附对照［16］。

301C最初是日本通商产业省(Ministry of International Trade and Industry，MITI)开发的方法，由于具有显著的优点，被很多国家采用。该方法采用专用的呼吸测定仪，配备六个作为反应容器的300 mL烧瓶，其中三个作为接种受试物质组，一个作为空白对照组［13］。

301D以BOD瓶作为反应容器，最少需要36个瓶。对于大多数受试物质，为了绘制出生物降解曲线的各阶段，保证取样的次数和频率，试验至少需要60个BOD瓶。由于接种细菌数较少，为确保试验的准确性，往往同时进行2个不同浓度(2和5 mg/L，以 ThOD 计)的试验，至少需要100 个瓶［14］。

4.3 各测试方法对试验水质的要求

为防止水中杂质、离子交换树脂及细菌、藻类产生的物质对试验结果的干扰，301A、301B、301C、301E、301F五种方法试验前要预先测定试验用水的DOC浓度，测得的DOC值不得高于受试物质浓度的10%［11-13，15-16］。301D 不需要预先测定水中 DOC浓度，但要求试验用水的耗氧量低，含接种微生物的空白对照组在28 d的耗氧量不应超过1.5 mg/L(以DO 计)［14］。

4.4 难溶受试物质的前处理要求

对于水中溶解浓度低于100 mg/L的受试物质，如果能保证其均匀分散在水中，可从301B、301C、301D、301F四种方法中选择一种。但是，采用搅拌、超声等方式使受试物质分散时，剪切力不能过强，要防止过热、泡沫过多。

301C不允许使用助溶剂或乳化剂进行前处理［13］。301B、301D、301F 三种方法，如果使用助溶剂促进受试物质溶解，或使用乳化剂使受试物质呈稳定的分散状态，就必须设助溶剂/乳化剂对照组，而且要求助溶剂、乳化剂在试验条件下不降解、不起泡，对接种微生物无毒害、无抑制作用［12，14，16］。

4.5 受试物质和参比物质的添加要求

根据受试物质和参比物质在水中溶解度的不同，采用不同的方法添加至试验容器中。对于水中溶解浓度高于1 g/L的物质，可事先配备合适浓度的储备液，试验时，再稀释成最终受试溶液，加入试验容器。

对于水中溶解浓度低于1 g/L的物质，在选择301B、301C、301D、301F 中的任一方法时，为避免稀释培养基缓冲液，不能采用配储备溶液的方式，只能直接溶于培养基或直接添加、分散到培养基中［12-14，16］。

301D特别要求用虹吸方法［14］向BOD瓶内加试验培养基、受试物质和参比物质，充满瓶。靠搅拌混合均匀，轻拍瓶壁排除气泡。

4.6 取样要求

对于水中溶解浓度低的物质，为了避免取样的误差，在取样前，要保证受试物质分散均匀。

301A和301E两种方法锥形瓶中的水分会随试验时间的延长而蒸发，要求取样前向锥形瓶中补充相应量的水并充分混合，而且要求将容器壁上附着物质再次溶解或悬浮。若采用2 L锥形瓶作反应容器，每个瓶的内容物定容至1 L，每2 d取样一次，每组一个瓶即可满足28 d的试验要求。缺点是，取样前补充水分的操作复杂且不易精确控制;随着试验时间的延长、取样次数的增加，烧瓶内容物体积变化较大。若301A、301E方法采用250 mL锥形瓶，每个瓶的内容物定容至100 mL，那么每个瓶只能取一次样，需要250 mL锥形瓶的个数将与取样次数相同。

301B采用2～5 L的试验烧瓶作反应容器，使用Ba(OH)2作吸收剂时，每组至少需要10个吸收瓶，28 d的试验至少需要70个吸收瓶。若为降低成本、节省空间，采用半透明的塑料瓶代替玻璃瓶作吸收瓶，将不利于观察瓶内沉淀。若使用NaOH代替Ba(OH)2作吸收剂，将减少CO2吸收瓶个数。吸收瓶适合用胶塞;若用磨口玻璃瓶和玻璃塞，通过碱与玻璃反应可达到密封效果，但损失的碱液会引起滴定的偏差。

301C采用专用的呼吸测定仪，每个烧瓶均配有特制的CO2吸收瓶，用碱石灰作吸收剂［13］，结构紧凑;能自动连续记录耗氧量，不需取样，操作简单。但价格较高，国内只有少数测试机构具备。

301D要求每次每组至少取两瓶，测定DO和pH后，将瓶弃去。如果按14 d观察期试验，至少每周取样一次;如果要确定10 d观察期，至少每周取样2次，或每2 d取样一次。这样，至少需要60个BOD瓶，操作较繁琐，劳动强度较大。

301F采用自动呼吸测定仪，自动连续记录耗氧量，不需取样，操作简单。

4.7 含氮受试物质的要求

如果选择301C、301D或301F测含氮物质的快速生物降解性，由于氮的硝化作用会消耗一部分溶解氧，使测定结果产生偏差。为消除这种干扰，应根据试验结束时NO3-和NO2-的浓度进行校正［13-14，16］。

关于六种方法的受试物质、接种微生物的选择、培养基成分、温度等操作要求和注意事项，将另文讨论。

5 常见问题及处理措施

5.1 缺少受试物质信息，测试方法选择不当

由于缺少溶解度、蒸汽压和吸附性方面的数据，或数据不准确，使选择的测试方法不适合该受试物质，导致试验结果不可靠。要解决、避免类似的问题，测试机构不但要具备熟悉各种快速生物降解性测试方法的技术人员，而且还要具备熟悉化学品常规理化性质测试的人员和进行验证理化参数的技术能力，对必要的参数能够进行验证试验或补测。

5.2 试验方案缺乏针对性，取样频次不够

对于301B、301D等非自动取样的试验，方法要求如果按14 d观察期试验，至少每周取样一次［12，14］。若不考虑受试物质的性质，试验方案一律按每周取样一次设计，由于数据少，某些受试物质生物降解曲线的变化趋势可能不明显。应对措施是，分析受试物质的结构信息，适当增加取样频次。

5.3 缺少水质数据，异常结果解释不清

试验用水的水质数据往往被忽视，对一些异常的试验结果，无法判断是由于水中杂质干扰还是由于试验操作不当所致。解决的措施是，定期对试验用水进行全分析，去除抑制微生物活性的物质;在试验前，检测试验用水溶解氧的消耗量或水中DOC浓度。

5.4 分散不均匀，试验结果不可靠

一些难溶的受试物质，在28 d的试验期间，分散体系失稳，或沉淀到瓶底，或上浮到液面，使试验结果不可靠。应对措施:应细心观察，及时发现异常并采取措施;对于不能恢复的，应在减少受试物质添加量的情况下，重新进行试验。

6 结论和建议

(1)化学品种类繁多，性质各异，每测一个物质的快速生物降解性，都相当于一项研究课题，绝不同于一般的检测工作。要准确、有效地测试化学品快速生物降解性，测试机构应具备物理化学、分析化学、环境微生物等方面的专业人员，并对六种经典方法深入研究、融会贯通。

(2)六种经典方法的适用范围不同，应根据受试物质的性质选择适当的测试方法。301A和301E只适用于易溶于水、不易挥发、不易吸附的物质;301B不适用于易挥发的物质。采用301C、301D、301F三种方法测含氮受试物质时，需要校正硝化作用的氧消耗。

(3)六种经典方法对设备和操作的要求各有不同，应根据受试物质的特性和测试机构仪器、设备、场地等条件，设计出有针对性的试验方案，采用合适的反应装置，减少、避免对试验结果的干扰。

(4)试验人员应严格按照各种方法的要求，认真操作，细心观察。对试验水质、分散体系的变化要及时发现并排除干扰。

［1］国家环境保护总局.化学品测试方法［M］.北京:中国环境科学出版社，2004.

［2］United Nations.Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals(GHS)［M］.3rd ed.New York:United Nations Publication，2009:215-240.

［3］van LEEUWEN C J，VERMERIRE T G.Risk assessment of chemicals an introduction［M］.2nd ed.Dordrecht:Springer，2007:73-409.

［4］Orgnisation for Economic Co-operation and Development.OECD guideline for testing of chemicals［M］.Paris:OECD Publications，1993.

［5］The Commission of The European Communities.Council Regulation(EC)No 440/2008［EB/OL］.［2008-05-30］.http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:142:0001:0739:en:pdf.

［6］中华人民共和国国务院.危险化学品安全管理条例［EB/OL］.［2011-03-11］.http://www.gov.cn/flfg/2011-03/11/content_1822902.htm.

［7］OECD.Test No.301:Ready Biodegradability［EB/OL］.［1992-07-17］.http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-301-ready-biodegradability _ 9789264070349-en;jsessionid =1816fjr8gttv3.delta.

［8］国家环境保护总局.HJ/T 153—2004 化学品测试导则［S］.北京:中国环境科学出版社，2004:6.

［9］中华人民共和国环境保护部.新化学物质申报登记指南［EB/OL］.［2010-09-16］.http://www.mep.gov.cn/pv_obj_cache/pv_obj_id_A307C2706731EC4386428C731D210489261E0900/filename/W020100921500388885939.pdf.

［10］周红，菅小东，聂晶磊，等.新化学物质环境管理技术规范体系的构建［J］.环境科学研究，2010，23(3):272-276.

［11］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21803—2008化学品快速生物降解性 DOC消减试验［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［12］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21856—2008化学品快速生物降解性 二氧化碳产生试验［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［13］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21802—2008化学品快速生物降解性改进的MITI试验(Ⅰ)［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［14］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21831—2008化学品快速生物降解性密闭瓶法试验［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［15］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21857—2008化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［16］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21801—2008化学品快速生物降解性呼吸计量法试验［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［17］OECD.Test No.310:Ready Biodegradability-CO2in Sealed Vessels(Headspace Test)［EB/OL］//OECD.OECD guideline for testing of chemicals.［2006-03-23］. http://titania.sourceoecd.org/vl=8728439/cl=14/nw =1/rpsv/cgi-bin/fulltextew. pl? prpsv =/ij/oecdjournals/1607310x/v1n3/s13/p1.idx

［18］OECD.Test No.209:Activated sludge，respiration inhibition test:OECD guideline for testing of chemicals［EB/OL］.［2010-07-23］.http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-209-activated-sludge-respiration-inhibition-test_9789264070080-en.

［19］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21796—2008化学品活性污泥呼吸抑制试验［S］.北京:中国标准出版社，2008.▷