张 芳，李立祥，陶 涛，李 惠

（安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部、农业部重点实验室，合肥230036）

早在《神农本草经》中就记载了久服茶叶能“安心、益气、轻身耐老”。茶叶中富含茶多酚、生物碱、多糖、茶氨酸[1]等化合物，对人体保健起着相当大的作用。茶叶不仅具有解渴、清热、明目、去腻减肥、解毒醒酒、延年益寿等功能[2]，还对现代疾病，如心脑血管病[3]、癌症[4，5]、辐射病[6]等相关疾病，有一定的药理作用。

果醋，被誉为“第四代饮料”，既保留了醋的功能，又具有果汁的特点，酸甜可口，极大改善了醋的口感。果醋作为一种新兴饮料，以其天然、健康、营养等优势已在市场上赢得一席之地。

迄今为止，关于茶醋生产工艺方面的文献报道不多。目前茶醋的研制主要是通过添加食用酒精和醋酸菌进行发酵或者直接将茶叶和食醋混合配制而成。如廖湘萍[7]等通过添加茶叶和食用酒精，以醋酸菌为菌种进行发酵得到保健型食醋；成剑峰[8]利用茶叶和大麦为原料，醋酸发酵生产茶醋饮品；王朝卿[9]将茶叶浸泡后与陈醋、蜂蜜等混合调配成茶醋饮料；张学良[10]等以桑椹醋、绿茶、冰糖和柠檬酸为原料，研制绿茶桑椹醋饮料，并对该饮料的减肥功能进行研究。然而关于将茶叶与水果混合，利用醋酸发酵生产保健茶醋的文献报道还没有。因此本文将茶叶通过浸提得到的茶汤与苹果汁混合，接种醋酸菌进行醋酸发酵酿造苹果茶醋，试制开发一种保健型的茶醋，能保留果醋和茶叶特点，旨在为新型发酵茶醋开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 原料及试剂

苹果（烟台红富士）：市售；茶叶（炒青）：市售；菌种：安琪葡萄酒用高活性干酵母（安琪酵母有限公司）；醋酸菌：沪酿1.01醋酸菌（上海迪发生物公司）；葡萄糖、碳酸钙、柠檬酸、偏重亚硫酸钾、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、酒石酸钾钠等均为分析纯；果胶酶、白砂糖均为食品级；琼脂（生化试剂）：天津市福晨化学试剂厂；酵母膏（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

手持折光计（上海测维光电技术有限公司）；附温比重瓶（上海信谊仪器厂）；PB-10酸度计（Sartorius公司）；UV-2102C型紫外-可见分光光度计（尤尼柯(上海)仪器有限公司）；SPX-150C型恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）；无菌操作台（上海三发科学仪器有限公司）；榨汁机（苏泊尔股份有限公司）；电子恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）；HQL150C型恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶醋生产工艺流程

1.3.2 指标方法测定

总糖：手持折光仪[11]；还原糖测定：3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS 法）[12]；酒精度：密度瓶法[13]；总酸：酸碱滴定法（以醋酸计）[13]；总酚含量：酒石酸亚铁比色法[14]。

1.3.3 醋酸发酵过程的研究

1.3.3.1 茶酒制备

茶叶研磨粉碎，过60目筛，采用微波结合水浴的方法提取，微波处理2次，每次3min,再用50℃水浴浸提1次10min[15]。茶多酚浸出率达90%以上。

取苹果，清洗干净，除残果去核，榨汁与茶汤按3∶1混合[15]，接种3%安琪葡萄酒用高活性干酵母，20℃静置发酵，备用。测定初始酸度、酒度、总酚含量。

1.3.3.2 影响醋酸发酵的单因素实验

在保持其他因素相同的条件下，分别考察不同温度、初始酒精度、接种量、发酵时间对醋酸发酵的影响，为正交法优化发酵工艺提供有意义的取值范围。

温度设计为 25℃，28℃，31℃，34℃，37℃，在接种量8%，初始酒精度6%的条件下发酵10d，测定发酵终止后的酸度，考察不同温度对醋酸发酵的影响。

初始酒精度设计为4%，5%，6%，7%，8%，理论上，1%的酒精产生1%的酸，1%的酸需要2%的糖发酵得到。因此将初始糖度设为8%，10%，12%，14%,16%。酒精发酵结束后测定酒精度。根据初始酒精度设计，利用1.3.3.1发酵好的酒精含量高的茶酒与酒精含量低的茶酒进行勾兑，得到所需的初始酒精度后，在温度31℃，接种量8%条件下发酵10d，测定发酵终止后的酸度，考察不同初始酒精度对醋酸发酵的影响。

接种量设计为2%，5%，8%，11%，14%，在温度31℃，初始酒精度6%条件下发酵10d，测定发酵终止后的酸度，考察不同接种量对醋酸发酵的影响。

发酵天数设计为 4d，6d，8d，10d，12d 在温度31℃，接种量8%，初始酒精度6%条件下发酵，测定发酵终止后的酸度，考察不同发酵时间对醋酸发酵的影响。

1.3.3.3 醋酸发酵条件的优化

在单因素试验的基础上，设计正交试验L16(45)，以最终达到的酸度为指标，研究温度、接种量、初始酒度、发酵时间对醋酸发酵的影响。找出对实验结果影响显著的因素，为确定最佳醋酸发酵条件提供依据。

表1 优化醋酸发酵工艺条件的正交试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 温度对醋酸发酵的影响

图1 温度对醋酸发酵的影响

如图1所示，25℃时醋酸发酵较为缓慢，产酸量不高；37℃时发酵很快，在第6天趋于平稳，但产酸量较低，这可能是由于温度过高，使得醋酸菌提前老化。因此，醋酸发酵的适宜范围是28℃～34℃。

2.2 初始酒度对醋酸发酵的影响

如图2所示，初始酒度为4%时，起始发酵速度快，但最终酸度过低，影响品质。初始酒度在5%～8%时发酵比较平稳且最终酸度随着初始酒精度的增加而增加。已有资料[16-18]表明，初始酒度高于10%以上，高酒精浓度会抑制醋酸菌的生长，不利于醋酸发酵的进行。因此，本文醋酸发酵的适宜初始酒度为5%～8%。

图2 初始酒度对醋酸发酵的影响

2.3 接种量对醋酸发酵的影响

图3 接种量对醋酸发酵的影响

如图3所示，醋酸菌接种量在2%时，发酵较慢且不彻底，最终酸度不高。接种量为5%～14%时差别不大，但接种量为5%时发酵相对缓慢。因此醋酸发酵的适宜接种量为5%～14%。

2.4 发酵时间对醋酸发酵的影响

图4 时间对醋酸发酵的影响

如图4所示，发酵前期(1d～2d)酸度上升缓慢，这是由于醋酸菌处于适应及增殖期，产酸量低；发酵中期(4d～10d)由于醋酸菌活力提高，发酵速度加快。发酵第10d，产酸达到最大值；发酵后期(10d～12d)醋酸菌活力减弱，酸度趋于一个稳定值，发酵基本结束。由此可知，醋酸发酵的最佳时间是10d。

2.5 醋酸发酵条件的优化

在单因素实验的基础上，按照表1设计的正交试验对醋酸发酵过程中的发酵温度、初始酒度、接种量及发酵时间等工艺参数进行优化。正交实验结果见表2，方差分析见表3。

表2 优化醋酸发酵工艺条件的正交试验结果

如表2所示，由极差分析得出影响醋酸发酵的最大因素为初始酒度B(R=12.15)，其次为发酵时间D(R=10.43)，接种量 C(R=4.3)，温度 A(R=3.75)。由此得知醋酸发酵最佳工艺参数为温度34℃，接种量7%，初始酒度8%，发酵时间为10d。

为了进一步验证以上结果，做出方差分析，如表3所示，由于E因素为空列，作为误差项计算。从结果中可以看出，B因素（初始酒度）和D因素（发酵时间）达极显著水平，C因素（接种量）为显著水平。因此，初始酒度和发酵时间是影响醋酸发酵的主要因素，所以生产中应重点控制；同时接种量也是要考虑的因素，应结合实际情况确定其添加量。

表3 醋酸发酵正交试验结果的方差分析

2.6 验证实验

按照正交实验得出的最佳工艺条件进行3次平行验证实验，结果表明，在最佳条件下发酵的茶醋，酸度平均达到62.7g/L，总酚含量为0.75g/L。

2.7 质量指标

2.7.1 感官指标[19-22]

发酵完的茶醋经陈酿后，澄清透亮，色泽淡黄，醋香浓郁，稍有茶香和果香，口感醇厚、平衡，具发酵特有风味。

2.7.2 理化指标

总糖（可溶性固形物含量）≥4%；总酸（以醋酸计）62.7g/L；还原糖（以葡萄糖计）≥10g/L；总酚0.75g/L。

2.7.3 微生物指标[23]

经检验，细菌总数≤100cfu/mL；大肠杆菌≤3 cfu/mL；致病菌：未检出。

3 结论

（1）本文以茶叶和苹果为原料，接种醋酸菌进行醋酸发酵，开发了一种新型发酵茶醋产品。通过单因素及正交实验得到发酵型茶醋最佳工艺参数为：温度34℃，醋酸菌接种量7%，初始酒度8%，发酵时间为10d。经过验证实验得到的茶醋最终酸度达到62.7g/L，总酚含量为0.75g/L。

（2）发酵得到的茶醋经过陈酿后澄清透亮，色泽金黄，醋味浓郁，稍有果香和茶香，酸味柔和，口感醇厚。

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