谢慧婷，王 静，陈振东，2，袁高庆* ，黎起秦，林 纬

1 广西大学农学院，南宁530004;2广西农业科学院蔬菜研究所，南宁530007

羊耳菊Inula cappa (Buch.-Ham.)DC.为菊科旋覆花属植物，主要分布于热带和亚热带的亚洲国家，位于亚高山、低山、干燥或湿润丘陵地、荒地、草地等。羊耳菊是传统的药用植物，含有多种有效活性成分，在医药药理作用和临床医学方面应用研究得比较广泛，已报道该植物所含化学成分有挥发油类、萜类、甾体类、有机酸类、芳香化合物、酰胺类、黄酮类、醇类、蒽醌类、香豆素类等［1］。在农业生产方面，平新亮等［2］曾报道羊耳菊甲醇提取物对菜青虫3 龄幼虫具有杀虫活性，药后72 h 的校正死亡率为50%，而在农用杀菌活性方面的应用迄今未见报道。

在前期筛选抑菌植物时，本文作者发现羊耳菊茎部甲醇提取物对水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用。水稻纹枯病由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起，是遍及全球的水稻重要病害，目前多采用抗生素和化学药剂防治。在过去的30 年里，大量持续的使用井冈霉素已导致我国水稻纹枯病菌产生一定的抗药性［3］，研究和开发新型生物药剂是一项水稻生产中亟待解决的问题。植物源农药因其生物活性高、安全性高、易降解、与环境相容性好、不易引起抗性等优点，成为当今国内外植保工作者的研究热点之一。植物源农药的种类包括植物源杀虫剂、植物源杀菌剂和植物源除草剂。我国地大物博，植物种类繁多，丰富的植物资源为植物源杀菌剂的研究提供了充足的资源保障。

本试验以水稻纹枯病菌为对象，对羊耳菊中的活性物质进行分离鉴定并测定分析其抑菌特性，以期为利用该抗菌物质开发防治水稻纹枯病的植物源杀菌剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

羊耳菊采自广西金秀瑶族自治县。羊耳菊茎部阴干粉碎后备用。

1.2 供试植物病原菌

供试植物病原真菌有:水稻纹枯病菌(R. solani)、杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niverum)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、茉莉枝枯病菌(Phoma putaminum)、番茄白绢病菌(Sclerotium rolfsi)、香蕉炭疽病菌(C.musae)、香蕉假尾孢叶斑病菌(Pseudocercospora musae)、香蕉弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)、柑桔褐色蒂腐病菌(Phompsis cytosporella)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、甘蓝黑斑病菌(Alternaria brassicae)。

植物病原细菌有:白菜软腐病菌(Pectobacterium carotovora pv. carotovora)、辣椒青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)和木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)。

以上植物病原菌菌株均由广西大学农学院植物病理学研究室提供。病原真菌的培养除烟草黑胫病菌用燕麦琼脂(Oat Meal Agar，OMA)培养基培养外，其他用马铃薯蔗糖琼脂(Potato Sucrose Agar，PSA)培养基培养;细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂(Nutrient Agar，NA)培养基和NA 培养液培养。

1.3 抑菌物质的提取分离和鉴定

参照溶剂浸渍法［4］，用甲醇溶剂浸泡羊耳菊茎部干粉(6000 g)，真空抽滤，减压浓缩，获得抑菌物质的粗提物(189.6 g)。取100 g 粗提物，采用液-液萃取法［4］，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4 种有机溶剂对羊耳菊甲醇提取物的水溶液进行萃取，获得各萃取物，测定其对水稻纹枯病菌的抑菌活性。

对具有较强抑菌活性的石油醚层萃取物(12.5 g)进行硅胶柱层析，石油醚-丙酮洗脱(100∶0、80∶1、40∶1、10∶1、1∶1)，最后甲醇冲柱，得到Fr.1～14，对水稻纹枯病菌具有抑菌活性的组分集中在Fr.4～9，将其合并，以石油醚-乙酸乙酯洗脱(100∶0、99∶1、98∶2、98∶3、98∶4、98∶6、1∶1)，最后甲醇冲柱，得到Fr.1～10，Fr.3 为橙红色精油，具有较强抑菌活性。以低温冷冻结晶法［5］对其固体结晶物进行多次纯化，最终获得单体化合物(0.7 g)。采用波谱法对分离到的活性化合物进行化学结构鉴定。

1.4 抑菌特性测定

1.4.1 抑菌活性测定

对植物病原真菌的活性测定采用菌丝生长速率法［6］，具体操作步骤是:将供试菌物在PSA 或OMA平板上活化培养，待菌落长满大半培养皿时备用。用溶剂溶解供试样品，与PSA 或OMA 培养基混匀，倒入直径为9 cm 的培养皿，制成厚薄均匀的含药带毒平板培养基，以含相同浓度溶剂的培养基作为对照。用直径为5 mm 的打孔器切取供试菌菌落边缘菌饼，反向接入含药带毒平板中央，置于28 ℃的恒温培养箱中培养，当对照菌落刚好长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径(mm)，以下列公式计算供试样品对植物病原真菌的抑菌率。每处理均3 次重复。

抑菌率(%)= 100 ×(对照菌落直径–处理菌落直径)/(对照菌落直径-5)

采取抑菌圈法［6］测定供试样品对植物病原细菌的抑菌活性。将25 mL 含有107CFU/mL 供试细菌的NA 培养基倒入培养皿中，用灭菌的5 mm 打孔器打孔，每孔加入供试样品药液50 μL，同时以相同浓度的溶剂作为对照，置于28 ℃的培养箱中恒温培养48 h。每个处理3 次重复，十字交叉法测量抑菌圈的直径，取平均值。

1.4.2 毒力测定

将供试样品稀释成一系列浓度梯度，采用菌丝生长速率法测定其对水稻纹枯病菌的抑菌率。将药剂浓度取对数值作为横坐标(x)，抑菌率换算成生物统计概率值作为纵坐标(y)，采用DPS v8.01 数据处理系统，以回归分析法计算抑菌中浓度(EC50)。

1.4.3 抑菌化合物的稳定性测定

将抑菌化合物置于不同的酸碱度(pH)、温度、紫外光和荧光等条件下处理。化合物在pH 值分别为1、3、5、7、9、11、13 的溶液中静置24 h;化合物药液分别置于0、20、40、60、80、100 ℃环境里恒温处理1 h;置于600 Lx 紫外灯下分别照射2、4、6、8、10 h;置于6000 Lx 日光灯下分别照射12、24、48、72、96 h。各条件处理的化合物均配制成50 mg/L 的药液，采用菌丝生长速率法测定其对水稻纹枯病菌的抑菌活性。以相同浓度的未经处理的化合物作为对照。

1.4.4 抑菌化合物的抑菌谱测定

抑菌化合物的质量浓度均为100 mg/L，以菌丝生长速率法测定其对16 种植物病原真菌的抑菌活性;以抑菌圈法测定其对4 种植物病原细菌的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 不同萃取物对水稻纹枯病菌的抑菌活性分析

石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取物对水稻纹枯病菌的抑菌中浓度分别为135.20、1123.60 和3886.45 mg/L，正丁醇和水萃取物没有抑菌活性。结果表明，羊耳菊对水稻纹枯病菌的抑菌活性物质主要存在于石油醚萃取物中。

2.2 抑菌化合物的结构鉴定

将石油醚萃取物进行硅胶柱层析分离和低温冷冻纯化，得到白色颗粒状化合物，对水稻纹枯病菌的菌丝生长具有强烈抑制作用，抑菌中浓度为47 mg/L。该化合物的波谱数据:1H NMR (600MHz，CDCl3)δ:7. 098～7. 085 (d，1H，-CH-)，6. 750～6.737 (d，1H，-CH-)，6.589～6.587 (s，1H，-CH-)，4.595 (s，1H，OH)，3.205～3.136 (m，1H，-CH-)，2.2849 (s，3H，-CH3)，1.260～1.248 (s，6H，-CH3);13C NMR (300 MHz，CDCl3)δ:152.516，136.612，131.293，126.238，121.681，116.022，26.737，22.671，20.857。与相关文献对照［7，8］，确定其为5-甲基-2-异丙基酚，即百里香酚(Thymol)，分子式为C10H14O。

2.3 百里香酚的抑菌活性稳定性

不同pH 值溶液和不同温度处理的百里香酚对水稻纹枯病菌的抑菌活性与对照一致;经紫外光和荧光照射不同时间后，百里香酚对水稻纹枯病菌的抑菌活性没有发生变化，说明百里香酚的稳定性较好。

2.4 百里香酚的抑菌谱

在16 种供试植物病原真菌中，除了对甘蓝黑斑病菌的菌丝生长具有微弱的促进作用外，100 mg/L的百里香酚对其他15 种真菌均表现出不同程度的抑制作用(见表1)，其中对水稻纹枯病菌、茉莉枝枯病菌、烟草黑胫病菌和香蕉弯孢霉叶斑病菌均表现出强烈抑制活性，它们的抑菌率没有显著差异;对瓜果腐霉、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌和番茄白绢病菌也具有较强的抑制作用，抑菌率大于70%;对西瓜枯萎病菌、杧果炭疽病菌和香蕉假尾孢叶斑病菌的抑菌活性相对较弱，抑菌率小于50%。

4 种供试植物病原细菌中，百里香酚对白菜软腐病菌和木薯细菌性枯萎病菌的抑菌活性较强，抑菌圈直径分别为16.62 和15.52 mm，对辣椒青枯病菌和番茄疮痂病菌表现出微弱的抑菌活性(见表2)。

表1 百里香酚对植物病原真菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of Thymol against plant pathogenic fungi

表2 百里香酚对植物病原细菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of Thymol against plant pathogenic bacteria

3 讨论

本研究采用生物活性追踪法，发现羊耳菊抑制水稻纹枯病菌的活性物质主要存在于其甲醇提取物的石油醚萃取层，通过反复硅胶柱层析，从中分离纯化出对水稻纹枯病菌具有较强抑菌活性的化合物，抑菌中浓度是47 mg/L，经鉴定为百里香酚。

百里香酚(5-甲基-2-异丙基酚)，又名麝香草酚，具特殊香气，存在于多种植物的精油中，有杀菌、抗氧化、消炎、祛痰、去蛔和除螨等活性，广泛应用于医学、香料业、食品业、化妆品业等行业［9］。虽然该化合物的理化性质和功能都已比较明确，但对植物病原菌的活性研究甚少。张静等［10］曾报道从地椒(Mongollian Thyme)中分离得到的百里香酚对番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、水稻纹枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麦纹枯病菌、稻瘟病菌和烟草赤星病菌均具有很强的抑制作用。Ji 等［11］发现，将百里香酚作为熏蒸剂处理土壤后，对番茄青枯病取得明显的防治效果。

本研究发现，从羊耳菊中分离得的百里香酚经过不同的酸碱度、温度、紫外光和荧光等条件处理后，其抑菌活性仍较稳定。该化合物除了对供试的甘蓝黑斑病菌没有抑菌活性外，对其他15 种植物病原真菌和4 种植物病原细菌均具有抑菌活性。综合本文及别人的研究结果表明，百里香酚抑菌谱广，活性稳定，具有防治多种植物病害的潜力和开发成植物源杀菌剂的应用前景。

致谢:本文采集的羊耳菊由广西大学农学院黎桦副教授鉴定，在此表示衷心的感谢!

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