应龙彬，俞桑桑，刘催萍，何仁锋，寿珍珍，胡根新，欧阳由男，沈 波

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036；2.中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，浙江杭州 310006）

高效液相色谱法对黑米中花色苷成分的测定

应龙彬1，俞桑桑1，刘催萍1，何仁锋1，寿珍珍1，胡根新1，欧阳由男2，沈 波1

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036；2.中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，浙江杭州 310006）

建立高效液相色谱（HPLC）检测黑米中花色苷类物质的方法.黑米粉经石油醚和乙酸乙酯去脂后，70%乙醇浸提、超声波处理、浓缩后，进行高效液相检测.该方法花色苷质量浓度在0.005 2～0.052mg/mL内具有良好的线性关系（R2＝0.999 8），平均回收率为99.72%，RSD为0.91%，花色苷最低检测限为0.1ng/mL.该方法操作简便快速，精密度和稳定性好，可用于从黑色稻米种质资源中筛选高花色苷含量的黑米品种.

黑米；花色苷；高效液相色谱

黑色稻米是指糙米（颖果）色泽为黑色的稻米，黑米成熟过程中，会在种皮内积聚大量花色苷色素，从而使其糙米呈现棕红色、紫红色、紫黑色乃至黑色等颜色［1－2］.研究表明，黑色素普遍存在于生物界，属于花色苷类化合物，可能结构有矢车菊素－5－葡萄糖苷、天竺葵－3－麦芽糖苷－5－葡萄糖苷等［3－5］.黑米花色苷作为一种天然食用色素，安全无毒、色彩鲜艳，是黑米具有药效的化学基础，具有广泛的疾病预防和健康促进作用，在食品和医药领域具有较大的应用潜力［6－8］.

目前对黑米花色苷的研究主要集中在花色苷资源分布的评价与资源库的建立、花色苷的生理活性与功能研究、花色苷的高效提取与绿色分离技术研究等方面，对黑米中花色苷成分的分析报导较少［9－13］.本研究应用高压液相色谱法（HPLC）检测黑米中花色苷的主要成分并作一探讨，以期为进一步从黑色稻米种质资源中筛选高花色苷含量和较纯花色苷组分的黑米品种奠定技术基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

以黑稻品种黑占86、花叶药糯和九阡黑糯为材料，由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供.

1.2 仪器与试剂

Waters600高效液相色谱仪，2487紫外检测器，数据采集和处理均在Waters工作站进行.

所用黑色素为矢车菊素－3－葡萄糖苷（cyanidin－3－glucoside）标准品，由上海安谱科学仪器公司提供；甲醇、甲酸为色谱纯，HP公司产品；水为超纯净水；乙酸乙酯、石油醚为分析纯.

1.3 色谱条件

色谱柱为Waters公司的Hanbon Benetnach C18柱（4.6mm i.d×250mm，5μm）.测定条件：流动相为甲醇－水（含1%甲酸），梯度洗脱（柱温：30℃）（0～3min甲醇质量分数为20%，3～25min甲醇由20%升至30%，25～35min甲醇质量分数为30%，35～40min甲醇由30%降至20%，40～45min甲醇质量分数为20%），流速为1mL/min，时间45min.矢车菊素葡萄糖苷溶液的检测波长为275nm，进样量为10μL.

1.4 供试品溶液的制备

供试品溶液的制备参照文献［14－16］进行.以成熟的黑米为原料，烘干粉碎过筛，获得实验用黑米粉.称取5g黑米粉，先后用石油醚和乙酸乙酯（固液比1∶10）超声去脂15min，风干.加入pH为2.0的70%乙醇（固液比1∶10），70℃水浴回流90min，提取2次，合并提取液，旋转蒸发浓缩至干，用10mL甲醇溶解，HPLC上样.

1.5 标准溶液的配制

精确称量矢车菊素－3－葡萄糖苷标准品1.3mg，用甲醇溶解，定容至25mL，配制得到0.052mg/mL的标准溶液.使用前配制成0.005 2～0.052mg/mL各质量浓度的标准溶液.

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

黑色素属于花色苷类化合物，在波长275nm和525nm处有较强吸收.为了确定矢车菊素葡萄糖苷甲醇溶液的适宜吸收峰，进行275nm和525nm波长的检测.结果（图1）显示，与525nm检测波长相比，275nm处有最大的响应，杂质的吸收峰较小，且基线波动较小，从而确定适宜检测波长为275nm.

2.2 HPLC分离条件的确定

花色苷类为弱酸性物质，在中性洗脱条件下，峰形易拖尾，需在流动相中加入弱有机酸，营造弱酸性环境［15］.采用甲醇－水洗脱系统并在水相中加入1%的甲酸，避免峰形太宽；同时，为减少杂质峰对目标峰形成的干扰，达到基线分离，以有效地对目标峰面积进行积分，保证定量分析的准确性，适当延长了分析时间，使目标峰达到基线分离，确保分离效果明显.按此优化的HPLC分离条件，标准品矢车菊素葡萄糖苷的保留时间为26.4min（图2）.

图1 矢车菊素－3－葡萄糖苷标准品在275nm和525nm的色谱图Fig.1 Chromatogram of cyanidin－3－glucoside standards in 275nm and 525nm

图2 矢车菊素－3－葡萄糖苷标准品的色谱图Fig.2 Chromatogram of cyanidin－3－glucoside standards

2.3 花色苷标准液的测定

将质量浓度为5.2～52μg/mL的矢车菊素－3－葡萄糖苷各标准品溶液，HPLC逐个进样，重复3次，计算平均峰面积.以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（图3）.当矢车菊素葡萄糖苷在5.2～52μg/mL之间时，其质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系，回归方程y＝7 179.6x－2 160.8，r＝0.999 6.最低检测限为0.1μg/mL.

将黑占86、花叶药糯和九阡黑糯黑色素的样品溶液分别进样，结果显示，3个黑米品种的花色苷成分均在26.4min处出现相应的峰，且与相邻峰基本达到基线分离，分离效果较好（图4A，B，C）.取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8h进样，测得峰面积分别为34 078、34 152、34 210、34 410和34 621，平均值为34 294.2，保留时间的RSD为0.64%，表明进样精密度良好.

图3 矢车菊素－3－葡萄糖苷标准曲线Fig.3 Standard curve of cyanidin－3－glucoside standards

2.4 样品含量测定和回收率

3个黑米品种经提取纯化后，HPLC上样.根据标准液的保留时间和样品的峰面积，测得黑占86、花叶药糯和九阡黑糯的矢车菊素葡萄糖苷质量浓度分别是0.032、0.139、0.525mg/g鲜重.

图4 不同黑米品种中矢车菊素葡萄糖苷的色谱图Fig.4 Chromatogram of cyanidin－3－glucoside in different black rice varieties

精确称取0.5g已知含量的黑占86米粉5份，分别加入0.06mg/mL的标准品矢车菊素葡萄糖苷2mL，按供试品溶液制备，进样10μL，测定含量.结果显示，平均回收率为99.72%，RSD为0.91%.

3 讨 论

目前，黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氧化进行化学合成，也可以从动植物材料中提取.相比而言，从植物中直接提取的天然黑色素安全性较高，应用范围更广，但生产中仍缺乏黑色素含量较高且具有开发利用价值的原料［17］.因此利用丰富的黑色稻米品种资源开展相关研究是很有应用前景.

尽管有利用毛细管电泳化学衍生荧光检测技术，定量分析食品黑色素新方法的报道［13］，但HPLC由于色谱柱、检测器等部件的日趋完善，灵敏度、选择性及数据处理能力得到极大地提高，应用HPLC分析黑米中花色苷成分更实用可行.本文通过对HPLC分离条件的优化，建立了适宜的黑米花色苷成分测定分析的方法，在灵敏度、重现性和回收率等方面可满足研究要求.

黑米作为重要的特种稻米，研究的重点主要侧重于农艺性状和主要营养成分的评价和分析.张名位等［18］分析了242份黑米品种，认为它们的总抗氧化能力、清除自由基能力、总黄酮和花色苷含量的变幅和变异系数均较大，表现出明显的基因型差异.在黑占86、花叶药糯和九阡黑糯3个黑米品种中，可以看到矢车菊素－3－葡萄糖苷含量的最大差异达16倍，一方面表明本文建立的黑米中花色苷成分的HPLC方法是可靠的，另一方面也表明从黑色稻米种质资源中筛选高花色苷成分的黑米品种及开展相关的育种研究是可行的.

［1］陈秀真.黑色稻米的营养特点与保健功能［J］.中国食物与营养，2006（10）：41－43.

［2］王艳龙，石绍福，韩豪，等.中国黑米花色苷研究现状及展望［J］.中国生化药物杂志，2010，31（1）：63－65.

［3］Butler M J，Day A W.Fungal melanins：a review［J］.Canadian Journal of Microbiology，1998，44（12）：1115－1136.

［4］马自超，庞业珍.天然色素化学及生产工艺学［M］.北京：中国林业出版社，1994.

［5］Paul Meredith，Tadeusz Sarna.The physical and chemical properties of eumelanin［J］.Pigment Cell Res，2006，19（6）：572－594.

［6］Ling Wenhua，Wang Linlin，Ma Jing.Supplementation of the black rice outer layer fraction to rabbits decreases atherosclerotic plaque formation and increases antioxidant status［J］.J Nutr，2002，132（1）：20－26.

［7］Hu Chun，Zawistowski J，Ling Wenhua，etal.Black rice（OryzasativaL.indica）pigmented fraction suppresses both reactive oxygen species and nitric oxide in chemical and biological model systems［J］.J Agric Food Chem，2003，51（18）：5271－5277.

［8］秦玉，凌文华.黑米花色苷提取物胶囊对高血脂症病人的降血脂作用［J］.食品科学，2008，29（10）：540－542.

［9］崔丽娜，高荣岐，孙爱清，等.不同基因型玉米籽粒类胡萝卜素与花色苷色素积累规律［J］.作物学报，2010，36（5）：818－825.

［10］侯方丽，张名位，苏东晓，等.黑米皮花色苷的大孔树脂吸附纯化研究［J］.华南师范大学学报：自然科学版，2009，2009（1）：100－104.

［11］夏效东，凌文华，郑琳，等.HPLC法测定黑米皮提取物中花色苷成分及含量［J］.食品科学，2006，27（2）：206－208.

［12］姜平平，吕晓玲，朱惠丽.花色苷类物质分离鉴定方法［J］.中国食品添加剂，2003（4）：108－111.

［13］张晓玲，杨桥，吴文惠，等.食品黑色素毛细管电泳分析新方法的建立［J］.食品科学，2008，29（6）：372－375.

［14］江友兴，刘希贞，龙小黎，等.黑米成分分析与功能利用［J］.农牧产品开发，1999（8）：8－9.

［15］杨萍，李琳.黑糯玉米黑色素的提取工艺的研究［J］.东北农业大学学报，2009，40（6）：97－100.

［16］曾盔，黄斌，王洁，等.黑米黑色素的提取与精制［J］.食品科学，2006，27（12）：304－307.

［17］王雨，汪佩雅，田志宏，等.甘蓝型油菜种子黑色素提取条件的优化［J］.安徽农业科学，2009，37（23）：11176－11178.

［18］张名位，郭宝江，池建伟，等.不同品种黑米的抗氧化作用及其与总黄酮和花色苷含量的关系［J］.中国农业科学，2005，38（7）：1324－1331.

Determination of Anthocyanin in Black Rice by High Performance Liquid Chromatography

YING Long－bin1，YU Sang－sang1，LIU Cui－ping1，HE Ren－feng1，SHOU Zhen－zhen1，HU Gen－xin1，OUYANG You－nan2，SHEN Bo1

（1.College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；
2.State Key Laboratory of Rice Biology，China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China）

The paper proposed a method to detect anthocyanin contents in black rice with HPLC.The black rice flour was extracted with ethyl acetate and petroleum ether under the assistance of ultrasound treatment followed by concentration.Then，the extract was analyzed by high performance liquid chromatography.A good linear relationship determined by HPLC method was observed when anthocyanin concentration was in the range of 0.005 2－0.052mg/mL（R2＝0.999 8）.The average recovery rate for anthocyanin was 99.72%with 0.91%of relative standard deviations（RSD），and the lowest limitation of anthocyanin is 0.1ng/mL.The method，which is simple，stable and accurate，can be used for screening black rice varieties with high anthocyanin contents from black rice germplasm resources.

black rice；anthocyanin；high performance liquid chromatography（HPLC）

S326

A

1674－232X（2012）01－0028－05

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.01.006

2011－09－26

国家科技支撑计划项目（2011BAD35B02）；生物科学国家特色专业建设项目.

沈 波（1965—），男，教授，博士，主要从事水稻生理与遗传研究.E－mail：bshen65＠163.com