李佳滨 张文杰 崔福斋 杜晓岩

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种存在于骨髓内的成体干细胞，因具有多向分化潜能和高增殖活性，目前已成为骨组织工程中理想的种子细胞。BMSCs可在成骨诱导培养条件下向成骨细胞分化[1]。研究证实，骨形态发生蛋白 2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2）是目前成骨诱导活性最强的骨形态发生蛋白之一，属于TGF-β超家族成员[2]。因纯化天然BMP2程序复杂，不易获得，所以基因重组的BMP2研发是目前研究的热点。本实验根据BMP-2的核心功能区氨基酸序列，合成一条含有17个核苷酸的P17-BMP2，旨在观察P17-BMP2联合成骨诱导剂促使BMSCs向成骨细胞分化的能力。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

P17-BMP2多肽（清华大学合成提供）；DMEMLG培养基、DMEM-HG培养基、胰蛋白酶（HyClone公司，美国）；青霉素、链霉素、特级胎牛血清(Gibco公司，美国)；β-甘油磷酸二钠（Sigma 公司，美国）；地塞米松（Sigma公司，美国）；抗坏血酸（Sigma公司，美国）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；CCK-8 试剂（日本同仁化学研究所）；荧光显微镜（Olympus IX70，日本）；核酸蛋白分析仪（DU-800，美国）；荧光定量PCR仪（MX3000P，美国）；高速冰冻离心机（Beckman 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离培养及分组

取4周龄Wistar雄性大鼠9只（上海第九人民医院动物实验中心提供），脱颈处死，75%乙醇浸泡消毒5min，无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，止血钳压碎，5 mL的DMEM完全培养基（含20%胎牛血清，100 mg/mL青、链霉素）冲洗骨髓腔，使骨髓细胞充分分散，将收集的骨髓用吸管打匀，加入离心管，1500 r/min离心5min，弃上清，用适量DMEM打匀制成单细胞悬液，取悬液1 mL（1只大鼠一培养皿）至 25 cm培养瓶，置于 37℃、5%CO2孵育箱中，48 h后换液，以后每 3天换液1次。待细胞汇合成80%～90%单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，继续培养，取第3代的细胞备用。……