宋 宇，黄可欣，李冬梅，石 搏

（1.吉林大学白求恩医学院形态学实验中心，吉林长春130021；2.长春大学特殊教育学院，吉林 长春130022）

硝酸镧对小鼠特异性抗体的形成、淋巴细胞转化和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

宋 宇1，2，黄可欣1，李冬梅2，石 搏1

（1.吉林大学白求恩医学院形态学实验中心，吉林长春130021；2.长春大学特殊教育学院，吉林 长春130022）

目的：观察硝酸镧作用后小鼠特异性抗体的形成、淋巴细胞转化及腹腔巨噬细胞吞噬功能的变化，探讨硝酸镧对小鼠免疫功能的影响。方法：昆明种小鼠60只，随机分为对照组、硝酸镧0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·Kg－1组，每组10只，分别给予小鼠腹腔注射生理盐水、硝酸镧0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·kg－11次；应用直接凝集法、3H－Td R掺入放射自显影术和吞噬鸡红细胞法，检测硝酸镧作用后小鼠抗A抗体的效价、被标记淋巴细胞转化比值和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的比值。结果：与对照组比较，硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1组小鼠抗A抗体的效价、被标记淋巴细胞转化比值和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比值均显著升高（P＜0.01）；与对照组、酸硝镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1组比较，酸硝镧10.0和20.0 mg·kg－1组小鼠抗A抗体的效价、被标记淋巴细胞转化比值和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比值显著降低（P＜0.01）。结论：小剂量硝酸镧对小鼠特异性抗体的形成、淋巴细胞转化及腹腔巨噬细胞吞噬功能具有明显促进作用，大剂量硝酸镧则具有明显的抑制作用。

硝酸镧；抗A抗体 ；放射自显影术 ；巨噬细胞

稀土元素共有17种，其中15种为镧系。镧系稀土元素具有许多优良的理化性质，被广泛应用于各行各业，因而导致了越来越多的稀土元素进入生物赖以生存的环境中，近年来很多报道已证实稀土元素可以通过食物链、呼吸道和皮肤等多种途径进入生物体内，并通过血液运输滞留或蓄积在各脏器组织内［1－3］。稀土元素对生态环境和人体健康的影响以及关于稀土元素近期及远期生物学效应的研究越来越引起人们的关注，大量的国内外研究报道［4－6］已证实：稀土是一类低毒性物质，适量摄入对机体心脏、肝脏、脾脏和血清激素等方面有良好的保护作用，而大量摄入则会对机体造成危害。镧元素在稀土元素中的应用较为广泛，一般常以化合物如氯化镧、硝酸镧形式存在，但目前国内外尚未见关于硝酸镧对小鼠免疫功能影响的相关报道。本研究探讨不同剂量硝酸镧对小鼠特异性抗体的形成、淋巴细胞转化和腹腔巨噬细胞吞噬功能影响，旨在证实低剂量硝酸镧对免疫功能的作用，为稀土元素应用于临床以及预防保健提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂 采用60只健康雄性昆明种小鼠，均为3周龄，体质量（15.48±1.42）g，由吉林大学医学实验动物中心提供。硝酸镧由北京稀土农用中心提供，3H－TdR购于北京原子能研究所，力豆蛋白（Con A）、低糖营养液（IMDM）、小牛血清购于四季青生物工程公司。

1.2 动物分组及给药 将小鼠随机分为6组，每组10只。第1组为对照组，第2～6组依次为硝酸镧0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·kg－1组。动物进行免疫之前做以下处理：对照组小鼠经腹腔注射生理盐水0.1 mL，第2～6组小鼠经腹腔注射硝酸镧（0.1、0.2、2.0、10.0 和 20.0 mg · kg－1）0.1 mL；各组小鼠每隔10 d注射1次，共注射3次。

1.3 动物免疫 各组小鼠经上述处理后，于次日取5个A型血人的混合新鲜血，用生理盐水洗3次后，按红细胞压积用生理盐水稀释10倍，制成红细胞悬液，经腹腔注射免疫；每隔10 d免疫1次，第3次免疫后10 d再加强免疫1次，3 d后进行后续实验。

1.4 抗体效价的测定 应用直接凝集法［7］测定抗体效价。首先稀释待检血清：取10支试管排列于试管架上，依次编号，用吸管在每管加入生理盐水，第1管加入0.9 m L，其余各管均加入0.5 m L。后吸取0.1 m L待检血清加入第1管内，吸入稀释液，再行吹出，重复3次，使混匀，该管含1∶10稀释血清。接着用同一吸管从第1管吸出0.5 m L加入第2管内，按上法混合，并以同法连续稀释至第9管，从该管内吸取0.5 m L弃去。如此每管内所含受检血清浓度为前一管的一半，即1∶10、1∶20、1∶40……，最后一管留作对照；其次加入抗原：每排各管加入诊断菌液0.5 m L，振摇试管架，充分混匀。此时血清的最终稀释倍数，从第1管开始，分别为1∶20、1∶40……末管为抗原对照；保温静置：37℃静置2 h，初步判读结果，然后移放冰箱过夜，再次判读。

1.5 被标记转化淋巴细胞比值检测 应用3H－Td R掺入放射自显影术。脱臼处死小鼠，取其脾脏在无菌条件下制成细胞悬液，营养液为含10%小牛血清、Con A的IMDM；将脾细胞悬液接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2温箱静置48 h后，加入3H－Td R，至终浓度为1 mCi·L－1，继续培养12 h后制成涂片标本，于暗室内红灯下涂核乳胶，放入暗盒中于4℃曝光，经显影、定影及HE染色后显微镜下观察。

1.6 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 应用吞噬鸡红细胞法［8］，即实验结束后将鸡红细胞注入小鼠腹腔，2 h后抽出腹腔液体置于干净的载玻片上，以95%酒精固定15 min，HE染色光学显微镜观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况。

1.7 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。抗A抗体效价、被标记淋巴细胞转化比值、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比值均以±s表示，多个样本均数组间比较采用方差分析。

2 结 果

与对照组比较，小鼠抗A抗体效价在硝酸镧0.1、0.2 和 2.0 mg·kg－1剂 量 组 升 高（P＜0.05），尤 以 0.1、0.2 mg·kg－1组 明 显；而 在10.0和20.0 mg·kg－1组降低（P＜0.01）。脾细胞悬液标本可见大型淋巴细胞均为转化淋巴细胞，部分转化淋巴细胞核内有黑色银颗粒，即为被标记转化的淋巴细胞。依次计数500个细胞，与对照组比较，硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组转化淋巴细胞比值升高（P＜0.05），尤以 0.1、0.2 mg·kg－1组明显（P＜0.01）；而在10.0和20.0 mg·kg－1组转化淋巴比值降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。对照组标本可见散在巨噬细胞、鸡红细胞，有少数巨噬细胞吞噬数个鸡红细胞；硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组标本可见大量巨噬细胞吞噬大量鸡红细胞，与对照组比较，硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比值升高（P＜0.01），尤以0.1、0.2组明显（P＜0.01）；而在10.0和20.0 mg·kg－1组腹腔巨噬细胞吞噬细胞鸡红细胞比值降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 硝酸镧作用后小鼠抗A抗体效价、3 H－Td R标记转化淋巴细胞比值和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比值Tab.1 The anti－A antibody titer，the 3 H－TdR marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice after treated with La（NO3）3 （n＝10，±s）

表1 硝酸镧作用后小鼠抗A抗体效价、3 H－Td R标记转化淋巴细胞比值和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比值Tab.1 The anti－A antibody titer，the 3 H－TdR marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice after treated with La（NO3）3 （n＝10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control group；＃P＜0.01 compared with La（NO3）3 0.1 mg·kg－1 group；△P＜0.01 compared with La（NO3）3 0.2 mg·kg－1 group；▲P＜0.01 compared with La（NO3）3 2.0 mg·kg－1 group.

Group Antibody titer Marked lymphocyte transformation ratio（η／%）Ratio of chicken erythrocytes（η／%）Control 2.196±0.211 70.430±0.135 53.360±0.021 La（NO3）3 0.1 mg·kg－1 2.932±0.091＊ 94.310±0.011＊＊ 99.810±0.032＊＊0.2 mg·kg－1 2.899±0.132＊ 93.260±0.112＊＊ 98.740±0.017＊＊2.0 mg·kg－1 2.741±0.203＊ 90.640±0.146＊ 95.490±0.025＊10.0 mg·kg－1 1.821±0.214＊＊＃△▲ 51.220±0.097＊＊＃△▲ 40.390±0.036＊＊＃△▲20.0 mg·kg－1 1.722±0.163＊＊＃△▲ 41.390±0.137＊＊＃△▲ 35.580±0.041＊＊＃△▲

3 讨 论

近年来，随着对稀土化合物生物效应研究的深入，稀土元素在农业及医药领域具有广泛的应用前景，因此其安全剂量的确定就显得尤其重要［9－11］。国内学者［12－13］报道：小剂量硝酸镧对脾脏的免疫功能有促进作用，大剂量硝酸镧有抑制作用，这是对机体自身免疫功能调节的证实。机体的免疫系统是由具有免疫功能的器官、组织、细胞和分子组成的，是机体免疫反应发生的物质基础。脏器指数是衡量机体免疫功能的初步指标，以T和B细胞介导的细胞免疫和体液免疫是反映机体免疫调节平衡状态的重要参数，单核巨噬细胞的吞噬能力可衡量机体非特异性免疫功能。因此，本研究主要从特异性免疫及非特异性免疫功能方面评价硝酸镧对机体免疫功能的调节作用。本实验应用人A型红细胞免疫小鼠后，刺激B淋巴细胞，经增殖、分化成为具有合成与分泌抗A抗体的浆细胞。检测小鼠血清中抗A抗体效价可以看出，硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组对抗A抗体形成有促进作用，尤以0.1和0.2 mg·kg－1组明显；而在10.0和20.0 mg·kg－1组有抑制作用，说明小剂量的硝酸镧具有刺激B淋巴细胞母细胞化、增殖及分化为浆细胞的功能，而大剂量则有抑制作用［7－8］。3H－TdR掺入放射自显影术检测结果表明：La（NO3）3在0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组对淋巴细胞转化具有促进作用，尤以0.1、0.2 mg·kg－1组明显；而在10.0和20.0 mg·kg－1组有抑制作用［9－10］。吞噬功能实验结果表明：硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组标本可见大量巨噬细胞吞噬大量鸡红细胞，与对照组比较，硝酸镧0.1、0.2和2.0 mg·kg－1剂量组吞噬功能增强，尤以0.1和0.2 mg·kg－1组明显；而在10.0和20.0 mg·kg－1组标本可见极少量吞噬现象，与对照组比较，其吞噬功能减弱。上述实验通过外源性刺激进一步证实小剂量硝酸镧对机体免疫功能有促进作用而大剂量硝酸镧对机体免疫功能有抑制作用。本实验结果表明：硝酸镧对小鼠的免疫功能有一定的调节作用，具体的免疫调节机制有待于进一步研究。

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Effects of La（NO3）3on formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and peritoneal macrophage phagocytic function in mice

SONG Yu1，2，HUANG Ke－xin1，LI Dong－mei2，SHI Bo1
（1.Morphology Experiment Center，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China；2.School of Special Education，Changchun University，Changchun 130022，China）

Objective To observe the changes of the formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and peritoneal macrophage phagocytotic function in mice after treated with La（NO3）3，and to explore the effect of La（NO3）3on immune function in mice.Methods 60 Kunming mice were randomly divided into control group，La（NO3）30.1，0.2，2.0，10.0 and 20.0 mg·kg－1groups，there were 10 mice in each group，and the mice in various groups were given intraperitoneal injection of saline，La（NO3）30.1，0.2，2.0，10.0，and 20.0 mg·kg－1once a day.Direct agglutination，3H－TdR incorporation radiation self－developing technique and phagocytic chicken erythrocytes were used to detect the anti－A－antibody titer，marked lymphocyte transformation ratio and ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages after treated with La（NO3）3.Results Compared with control group，the anti－A antibody titer，the marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice in La（NO3）30.1，0.2 and 2.0 groups were increased significantly（P＜0.01）；compared with control，La（NO3）30.1，0.2 and 2.0 groups，those indexes mentioned above in La（NO3）310.0 and 20.0 mg·kg－1groups were decreased significantly（P＜0.01）.Conclusion Small doses of La（NO3）3can promote the formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and phagocytic function of peritoneal macrophages and large doses of La（NO3）3have significantly inhibitory effects in mice.

La（NO3）3；anti－A antibody；autoradiography；macrophages

R392.12

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1048－04

2012－06－22

国家自然科学基金资助课题（29890208）

宋 宇（1970－），男，吉林省长春市人，讲师，医学硕士，主要从事稀土生物学效应的研究。

黄可欣（Tel：0431－85619734，E－mail：huangkx＠jlu.edu.cn）

时间：2012－10－2509：34

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20121025.0934.002.html