金俊成，常文贵，高 云

（1.皖西学院 材料与化工学院，安徽 六安237012；2.安徽仿生传感与检测技术省级实验室，安徽 六安237012）

1 引言

光散射是指一束光线通过介质时在入射光以外的方向上观察到的光现象，它是电磁辐射与物质相互作用的一种表现形式。光散射技术在物理化学、胶体化学、高分子化学研究中具有十分重要的地位。1993年R F Pasternack等［1］用特殊的共振光散射技术研究了卟啉类化合物在核酸上的聚集，首次将该技术与化学过程联系起来。目前这种技术被广泛应用于核酸［2］、蛋白质［3］、肝素［4］等生物大分子的研究和测定，应用于痕量金属［5］、非金属［6］、无机小分子［7］和某些有机物如表面活性剂［8］的测定，此外，对某些药物测定［9］、在纳米技术［10］方面也有一定的应用。

蛋白质、核酸和糖类是构成生物体的基本物质，担负着生命活动过程中多种极其重要的功能。因此，蛋白质定量测定是生物化学、临床检验中疾病诊断和检查治疗效果、药物分离提纯及食品检验中常见的分析项目。测定蛋白质含量的方法有很多，目前应用最广的有吸光光度法、荧光光度法等。近年来，共振瑞利散射法因其灵敏度高，选择性好，用于测定蛋白质已引起人们广泛关注［11］。

本文研究了酸性偶氮染料苋菜红 （Amaranth）与蛋白质体系的共振散射光谱。在pH为3.80的介质中加入蛋白质后，苋菜红-蛋白质体系的共振光散射显著增强。优化了该反应体系用于测定蛋白质的反应条件，并用于测定鸡蛋清试样中总蛋白质含量。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

RF-5301PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

卵清白蛋白（OVA）（天津华美生物工程公司产品）；苋菜红（天津市光复精细化工研究所 ）；邻苯二甲酸氢钾；盐酸。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

2.2 实验原理

瑞利散射（RS）是散射光波长等于入射光波长，而且散射离子（如分子）又远小于入射光波长产生的弹性散射，其散射强度与波长的4次方成反比。若散射峰在吸收峰附近或位于吸收带中，则能产生更强的瑞利散射，使散射强度急剧增强。这主要是由于散射与吸收的共振作用，产生了一个吸收-再散射的过程，从而使散射光强度提高几个数量级，此时偏离散射光强度与入射光波长的4次方成反比关系，这种吸收-再散射的过程称为共振瑞利散射（RRS）。

大多数有机染料能以静电结合于蛋白质表面，形成聚合体，聚合体体积远远大于有机染料自身的聚集体积，光散射信号与聚合体体积的2次方成正比，与聚合体浓度成正比。因此，染料与蛋白质结合后，光散射强度大大增加且与加入蛋白质浓度成线性关系。在酸性条件下，由于带负电荷的苋菜红与带正电荷的蛋白质通过以静电引力为主的分子间作用力结合为复合物，使体系的共振光散射明显增强，并在一定范围内与蛋白质浓度成线性关系。

2.3 实验方法

于10mL比色管中依次加入0.60mL 1.0×10-4mol／L的苋菜红溶液，1.0mL pH 值为3.80的 Clark-Lubs缓冲溶液以及一定量的蛋白质溶液，以二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀。15min后，在荧光分光光度计λex＝λem＝523nm时测定体系的共振散射光强度。

3 结果与讨论

3.1 苋菜红-蛋白质体系的共振光散射光谱

图1为Δλ＝0nm条件下同步扫描激发与发射波长所得的苋菜红-OVA体系的共振光散射光谱。从图中曲线可以看出单独的苋菜红（曲线1）与OVA溶液（曲线2）的共振光散射强度比较弱，当它们混合后体系的共振光散射显著增强（曲线3），约在523nm处ΔI有最大值。表明带负电荷的苋菜红与带正电荷的OVA通过以静电引力为主的分子间作用力结合为缔合物，使体系的共振光散射增强。

图1 苋菜红-OVA体系的共振瑞利散射光谱

3.2 反应条件的选择

3.2.1 反应时间与稳定性

图2为OVA-苋菜红体系在不同时间里的共振瑞利散射强度。由图2可见，苋菜红与OVA的反应迅速，室温条件下10min即可反应完全，并且在3h内荧光强度基本稳定不变。因此实验选择反应时间为15min。

3.2.2 反应酸度的选择

图2 OVA-苋菜红体系荧光强度随反应时间的变化曲线

在50mL 0.2mol／L的邻苯二甲酸氢钾溶液中加入0.2mol／L的 HCl溶液，配成一系列不同pH值的缓冲液。实验结果如图3所示，当溶液酸度在2.90～4.00之间变化时，苋菜红的光散射强度基本不变（曲线1），而OVA-苋菜红复合物的共振光散射强度ΔI则在pH＝3.80时达到最大值（曲线2），随后ΔI随着pH值的增大而降低。实验选择pH＝3.80的Clark-Lubs缓冲溶液控制反应酸度。

图3 酸度对OVA-苋菜红体系荧光强度的影响

3.2.3 苋菜红浓度的影响

在pH值为3.80的Clark-Lubs缓冲液中，分别取0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8 mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL1.0×10-4mol／L的苋菜红溶液配成一系列不同浓度下的体系，分别测定体系的荧光强度，如图4所示。由图4可见，苋菜红浓度较小时，复合物的ΔI值较小，这是由于OVA不能与苋菜红充分结合。当其浓度达到7.0×10-6mol／L时，ΔI值最大。继续增大苋菜红浓度，则ΔI值又减小，这是因为苋菜红本身的光吸收使光散射强度减弱。实验结果选择苋菜红浓度为7.0×10-6mol／L。

3.2.4 电解质氯化钠的影响

在相同的实验条件下，试验不同浓度的电解质NaCl对体系共振光散射强度的影响，结果如图5所示。从图5可以看出，当电解质NaCl的浓度小于4.5×10-3mol／L时对体系的共振散射强度基本上不产生影响。继续增大NaCl的浓度，则导致共振散射强度下降。

3.2.5 共存物质的影响

图5 电解质NaCl对OVA-苋菜红体系荧光强度的影响

在0.5mg／LOVA存在下，试验了氨基酸及一些常见金属离子对反应的干扰作用。试验结果列于表1中（表中I1、I2分别表示OVA溶液和加入干扰组分后溶液的荧光强度）。从表1中可以看出，氨基酸 （甘氨酸、色氨酸、精氨酸 ）和常见金属离子（如钙、镉、铜、铁、镁、锌 ）基本上不影响蛋白质的测定。

表1 氨基酸及金属离子对反应的干扰作用

3.3 工作曲线的绘制

配制一系列不同浓度的OVA溶液，按2.3实验方法，在优化的实验条件下，分别测定它们的共振光散射强度I，以二次蒸馏水作试剂空白测定其散射光强度I0，散射光增强值ΔI＝I-I0。以浓度C对ΔI作图，绘制工作曲线如图6所示。蛋白质的浓度在1.5～5.0mg／L范围内与ΔI呈良好的线性关系，其回归方程分别为：ΔIOVA＝11.755 COVA＋106.946，相关系数R＝0.9869。

图6 不同浓度OVA的共振光散射强度，内插图为工作曲线

3.4 检测限的测定

对空白试样进行11次平行测定，其共振光散射强 度 分 别 为：3.215、3.013、3.108、3.207、3.018、3.129、3.115、3.152、3.037、3.14、3.201。计算得出标准偏差S＝0.0687，OVA的检测限为209μg／L。

3.5 样品分析

用上述方法对鸡蛋清中总蛋白质含量进行测定。测定时，首先将新鲜的鸡蛋清样品10g加水100mL稀释，再从稀释液中取1.0mL加入到含有0.6mL 1.0×10-4mol／L的苋菜红溶液和1.0mL pH 值为3.80的Clark-Lubs缓冲溶液的10mL比色管中，以二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀，15min后测定其共振光散射强度。以测得的相应ΔI计算蛋白质的浓度，结果列于表2中。

表2 共振瑞利散射光谱法鸡蛋清中总蛋白质含量测定结果

4 结论

研究了共振瑞利散射法测定蛋白质含量的方法，分别试验了反应时间、反应酸度、苋菜红浓度对测定结果的影响，另外，试验了电解质NaCl、共存物质（氨基酸和金属离子）的影响。在确定的实验条件下，对OVA进行了测定，并对鸡蛋清样品中总蛋白质进行了测定。实验结果表明：共振光散射法测定蛋白质含量，方法灵敏度高，操作简便、快速，稳定性好，适用于蛋白质的微量分析。

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