邓亚利，周莉玲（1.华南农业大学制药工程系，广州510642；2.广州中医药大学，广州510405）

青风藤、雷公藤抗炎抗风湿疗效确切，临床上应用广泛。青风藤有效成分主要为青藤碱；雷公藤有效成分主要为雷公藤内酯醇（甲素）[1，2]。本研究拟通过合理组方，以青风藤、雷公藤配成药对，组成复方，制成复方巴布剂，对其合用后药物释放及其透皮行为进行研究，并与青藤碱、雷公藤甲素单体组成的复方巴布剂进行比较，探讨外用替代口服、复方替代单方的可行性与优越性。

笔者对2种巴布剂的体外释药和透皮吸收特征[3，4]进行数学模型拟合，探讨制剂中药物的释放机制，同时考察经皮给药后2种有效成分局部药物浓度随时间变化的规律，并预期合用后其治疗特点，为其他复方中药经皮给药系统的研发提供借鉴。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Summit P680型高效液相色谱仪，由PDA-100型二级管阵列检测器、ASI-100型自动进样器、Summit恒温箱、Chromeceon色谱工作站组成（德国Dionex公司）；ZRS-4型智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）；TK-12A型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；TGL-16型高速台式离心机（上海医疗器械六厂）。

1.2 试药

双藤巴布剂（STEP）、青藤碱雷公藤甲素巴布剂（STP）由笔者自制（均含青藤碱 2.5 mg·cm－2、雷公藤甲素 25 μg·cm－2）；青藤碱对照品（批号：0774-200105）、雷公藤甲素对照品（批号：111567-200502）均由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 动物

4周龄BALB/C裸鼠，♂，体重（20±2）g，由广州中医药大学实验动物中心提供（动物生产合格证号：0028166）。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（0.005 mol·L－1磷酸氢二钠溶液，以0.005 mol·L－1的磷酸二氢钠调pH值至8.0，再以1%三乙胺调pH值至9.0）＝55∶45；检测波长：225 nm。理论板数按青藤碱峰计算应不低于1500。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取青藤碱、雷公藤甲素对照品各适量，用甲醇配成每1 mL含青藤碱0.2352 mg、雷公藤甲素40.512 μg的对照品贮备溶液，贮藏，备用。精密吸取对照品贮备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，甲醇定容，得青藤碱（9.41 μg·mL－1）与雷公藤甲素（1.62 μg·mL－1）对照品溶液，将此溶液分别进样1、2、4、6、8、10 μL；精密吸取对照品贮备溶液5 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，分别进样1、2、4、8、12、16、20 μL。以青藤碱、雷公藤甲素进样量（X）为横坐标，相应峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得青藤碱的回归方程为Y＝0.0281X－0.0205（r＝0.9998，n＝6）与Y＝35.142X－0.1393（r＝0.9994，n＝7）。结果表明，青藤碱进样量在9.41～94.08 ng与0.12～2.35 μg之间与其峰面积积分值呈良好线性关系。雷公藤甲素的回归方程为Y＝0.0487X－0.0135（r＝0.9995，n＝6）与Y＝0.0369X+0.0356（r＝0.9999，n＝7）。结果表明，雷公藤甲素进样量在3.24～16.20 ng与20.26～405.12 ng之间与其峰面积积分值呈良好线性关系。

2.1.3 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品贮备液（含青藤碱0.2352 mg·mL－1、雷公藤甲素40.512 μg·mL－1）、对照品溶液（含青藤碱9.41 μg·mL－1、雷公藤甲素1.62 μg·mL－1），分别按“2.1.1”项下色谱条件测定。日内精密度（n＝6）结果：青藤碱峰面积的RSD为1.04%与1.86%，雷公藤甲素峰面积的RSD为1.22%、1.88%；日间精密度（n＝5）结果：青藤碱峰面积的的RSD为1.26%、1.93%，雷公藤甲素峰面积的RSD为1.72%、1.98%，表明该方法精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，室温条件下每隔2 h进样1次，8 h内测定4次。结果，青藤碱峰面积的RSD为1.56%（n＝4），雷公藤甲素峰面积的RSD为1.97%（n＝4），表明在室温条件下检测成分8 h内稳定。

2.1.5 加样回收率测定 精密吸取青藤碱（9.41 μg·mL－1）与雷公藤甲素（1.62 μg·mL－1）对照品溶液5.0 mL，氮气吹干，甲醇定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，取续滤液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，青藤碱的平均回收率为99.86%（RSD＝1.03%，n＝6），雷公藤甲素的平均回收率为97.56%（RSD＝1.02%，n＝6），表明该方法准确度良好。

2.1.6 最低检测限测定 按信噪比（S/N）＝3作为最低检测限，测得雷公藤甲素的最低检测限为1.62 ng，青藤碱的最低检测限为9.41 ng。

2.2 体外释放度试验

参照2005年版《中国药典》释放度测定第三法进行。释放介质为30%乙醇-生理盐水。量取经脱气处理过的释放介质250 mL注入溶出杯内，预温至（32±0.5）℃。取经皮给药制剂各1片（面积为25 cm2），分别固定于两层不锈钢碟片的中央，释放面朝上，再将网碟置于溶出杯下部，使制剂与桨底旋转面平行，两者相距（25±2）mm。开始计时，转速为100 r·min－1，分别于1、2、4、6、8、12、16、24 h取样5 mL，取样位置在介质液面与桨叶上端之间正中，离溶出杯壁距离1 cm。每次取样后立即补充相同体积的空白释放介质。

取上述溶出液1 mL，氮气吹干，甲醇定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，取续滤液5 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定青藤碱、雷公藤甲素的峰面积，根据对照品的峰面积计算其浓度。按以下公式计算单位面积累积释放量（Q，μg·cm－2）：

式中，Cn为第n个取样点测得的药物浓度（μg·mL－1）；Ci为第i（i＝n－1）个取样点测得的药物浓度（μg·mL－1）；D为制剂中青藤碱、雷公藤甲素含量（μg）。

青藤碱与雷公藤甲素的累积释放量见图1。

将STP与STEP经皮给药制剂的单位面积的Q分别对时间（t，h）按零级、一级与Higuchi动力学方程进行线性回归，解释其释药机制[6]。结果均以Higuchi方程拟合度较优（STP中：r青＝0.9955，r甲＝0.9958；STEP中：r青＝0.9920，r甲＝0.9963），说明2种制剂均属骨架型释药系统。药物以微细的粒子混悬分散在基质中，每单位体积基质所含溶解与混悬药物总量比药物在基质中的饱和浓度大，药物的释放量与时间的平方根成正比。青藤碱、雷公藤甲素以单体入药和以浸膏入药，在相同基质中的释药速率（J）基本相同。青藤碱、雷公藤甲素的体外释放动力学方程分别见表1、表2。

表1 青藤碱的体外释放动力学方程Tab 1 In vitro release kinetics equation of sinomenine

表2 雷公藤甲素的体外释放动力学方程Tab 2 In vitro release kinetics equation of triptolide

由表1、表2可知，2种经皮给药制剂的体外释药随时间为一个递增过程。青藤碱在STP、STEP中，24 h的累积释放百分率（Q%）分别为83.52%、78.09%；J分别为468.5、455.58 μg·cm－2·h－1/2。雷公藤甲素在STP、STEP中，24 h的Q%分别为80.32%、75.26%；J分别为4.6112、4.3879 μg·cm－2·h－1/2。

2.3 体外透皮试验

采用透皮扩散试验仪[5]，先将磁搅拌子放在接收池内，再将制备的离体裸鼠背部皮肤平放在接收池上端，角质层面向上，然后将释放池用夹子固定于接收池上。在接收室中注入接收液7 mL，保持（32±0.2）℃恒温水浴，磁力搅拌转速为（200±5）r·min－1，预平衡1 h。倒掉接收池中的溶液，加入空白接收液。释放池中放上巴布剂，于预定的间隔时间（2、4、6、8、10、12、16 h）分别取样5 mL，每次取样后补加相同体积的新鲜接收液并排除接收室中的气泡。

取上述溶出液5 mL，氮气吹干，甲醇定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，取续滤液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，根据对照品的峰面积计算其浓度。按以下公式计算Q

式中，Cn、Ci、D的意义同“2.2”项下。

以STP、STEP中青藤碱和雷公藤的Q和Q%对t（h）分别按零级、一级与Higuchi动力学方程进行线性回归，可知2种巴布剂的经皮渗透可较好地拟合零级动力学方程。青藤碱在STP、STEP中的r分别为0.9951、0.9926；透皮速率（J）分别为 21.729、20.063 μg·cm－2·h－1。雷公藤甲素在STP、STEP中的r分别为0.9942、0.9902；J分别为0.4783、0.4168 μg·cm－2·h－1。STP与STEP中青藤碱、雷公藤甲素的体外透皮动力学方程分别见表3、表4。和Q%。

表3 STP与STEP中青藤碱的体外透皮动力学方程Tab 3 Transdermal rate parameters and equations of sinomenine in STPand STEP

表4 STP与STEP中雷公藤甲素的体外透皮动力学方程Tab 4 Transdermal rate parameters and equations of triptolide in STPand STEP

2.4 药物释放机制探讨

将STP、STEP中青藤碱、雷公藤甲素的体外释放数据代入Ritger-Peppas：Q%＝ktn模型进行拟合，判断其从巴布剂中释放的机制，并将两者进行比较。结果，2种巴布剂中各组分体外释放的扩散指数0.45＜n＜0.89，说明药物的释放机制是非Fick扩散（药物的扩散和骨架溶蚀协同作用）；2种巴布剂中各组分的体外透皮指数n＜0.45，说明药物的透皮机制是Fick扩散。STP与STEP中青藤碱、雷公藤甲素的体外Ritger-Peppas模型释放参数见表5。

表5 STP与STEP中青藤碱、雷公藤甲素的体外Ritger-Peppas模型释放参数Tab 5 Ritger-Peppas model release parameter of sinomenine and triptolide in STPand STEP

3 讨论

释放度是指药物从该制剂在规定的溶剂中释放的速度和程度。经皮给药过程包括药物在基质中扩散、在皮肤表面分配、通过皮肤渗透3个连续过程。故巴布剂的溶出度或释放度测定在一定程度上可反映药物在经皮给药装置中的传递性能，为评价给药过程的限速步骤提供参考数据。

对于经皮给药制剂释放度研究，目前公认的试验方法是采用药典所规定的释放度测定第三法（小杯法），故本研究采用小杯法。小杯法中制剂的状态较为稳定，搅拌对基质的影响较小，溶出液澄明度好。本研究采用的溶出介质为30%乙醇生理盐水溶液，在长时间的试验中，应注意溶出过程中的介质蒸发量，这种损失量可能对释放度测定结果的准确性产生较大影响。

2种巴布剂中的有效成分体外经皮渗透行为略有所不同。单体入药的青藤碱、雷公藤甲素透皮速率均稍大于浸膏入药的2种成分；但浸膏入药的STEP时滞较小，推测与浸膏中其他成分存在有关。

药物的经皮吸收过程包括扩散和代谢2个过程。许多药物的药理作用的强度和持续时间取决于在机体中的代谢失活情况。所有进入活性皮肤中的药物分子及经皮全身性吸收的药物分子都要经过皮肤中酶的代谢作用。体外通透试验很少能获得有关代谢、分布和血流对通透性影响的信息，所以在体的透皮实验研究很有必要[6]。

因体外释放与体外透皮浓度变化范围较大，故采用2条标准曲线以满足不同检测浓度需要；体外释放与体外透皮取样后，经过氮气吹干甲醇定容后按色谱条件进样，对此过程造成的测量误差进行了回收率试验，结果表明该处理方法简单、回收率良好。

在主要有效成分含量相同、基质相同的STP、STEP巴布剂中，体外释放因为溶出介质量较大，与成分的饱和浓度相差较远，故单体入药与浸膏入药释放速率相近，无显著性差异。而皮肤透过试验中，因为单位面积皮肤对透过量有饱和性，在其他成分存在的情况下，可能会限制有效成分的透过速率，所得浸膏入药的透皮速率低于单体入药的透皮速率。

[1]刘春芳，林 娜.雷公藤甲素抗类风湿性关节炎机制研究进展[J].中国中药杂志，2006，31（19）：1575.

[2]王 岩，周莉玲.促渗剂对青藤碱脂质体透皮贴剂经皮渗透的影响[J].中药材，2005，28（7）：567.

[3]郝保华，王彦玲，李伟泽，等.青风藤电离巴布剂电致孔透皮给药的药动学研究[J].中草药，2009，40（7）：1060.

[4]高运军，李 丽，李 文.癌痛宁巴布剂中乌头碱的体外透皮吸收研究[J].中成药，2008，30（11）：1619.

[5]祁 艳，陈 军，李 磊，等.不同促渗剂对马钱子碱贴剂体外透皮吸收的影响[J].中国药房，2011，22（3）：195.

[6]郑俊民.经皮给药新剂型[M].北京：人民卫生出版社，2006：236、265.