刘爱东，成 敏

(1．遵义医学院生理学教研室，贵州 遵义 563099;2．潍坊医学院生理学教研室，山东 潍坊 261041)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是排除了高血压、冠心病及其它已知疾病所致的心肌损伤而独立存在的病理生理状态，表现为心肌肥大，心脏收缩和(或)舒张功能障碍。其发病机制尚不清楚，实验研究指出多种代谢紊乱构成了糖尿病心肌功能和结构改变的基础。而原癌基因的激活与表达增强是心肌肥大发生的重要途径之一。本实验应用链尿菌素(streptozocozin，STZ)诱导的糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠为研究对象，通过观察胰岛素(Insulin)或灯盏花素(Breviscapine，Bre)对DM早期大鼠血糖、心肌原癌基因c－myc表达的影响，探讨Insulin或Bre对糖尿病模型大鼠心肌的保护作用。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 STZ(Alexis公司);Bre(云南个旧生物药业有限公司，规格为5mL∶20 mg);总RNA提取试剂盒和DEPC购自华美生物工程公司;ONE－STEPRT－PCR试剂盒购自Qiagen公司;血糖测定试剂盒购自四川省迈克科技有限责任公司;引物由上海生工合成。

1．2 实验动物分组及给药 雄性Wistar大鼠(n=48)，体重(225±26)g，购自四川大学动物中心(Ⅱ级，证书编号24101107)。大鼠适应性喂养一周后，用简单随机抽样方法随机选取12只为正常对照组(Normal组)，余36只禁食10 h后按(60 mg·kg－1，ip)一次性腹腔注射STZ溶液。STZ溶液临用前用0．1 mmol·L－1枸橼酸缓冲液(pH 4.5)配成1%浓度，Normal组注射等容积0．1 mmol·L－1枸橼酸缓冲液。给药48 h后经尾静脉采血测定空腹血糖，以血糖值≥16.65 mmol/L作为糖尿病大鼠成模标准。建模成功后，再用简单随机抽样方法随机分为糖尿病非用药组(DM组，n=12 NC 0．2 ml·kg－1·d－1，ip)，胰岛素治疗组(Insulin 组，n=12，Insulin 2 U·kg－1·d－1，sv)，Bre 治疗组(Bre 组，n=12，Bre 100 mg·kg－1·d－1，ip)，Normal组(n=12，NS 0．2 mL·kg－1·d－1，ip)，各组连续给药7 d。给药期间各组大鼠自由进水、饮食，DM组、Insulin组和Bre组各死亡1只。

1．3 实验观察及标本留取 各组分别在模型建立后的第1天、第3天、第7天测量血糖及称体重。取各组第3天的大鼠(每组n=6)，在测量血糖及称体重完毕后，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后剪开胸腔，迅速摘除心脏，吸干血液后，放入液态氮中冷冻，留用RNA提取。

1．4 血糖测定 葡萄糖氧化酶法，单位以mmol/L计。

1．5 逆转录 －聚合酶链反应(RT－PCR检测)1．5．1 心肌组织总RNA的提取 按照Trizol试剂盒说明操作，在紫外线分析仪上测定RNA浓度及A260/A280吸光度比值(1．80 ～2．12)，以确定RNA纯度。

1．5．2 引物的选择 c－myc和 β－ actin的 PCR特异性引物的选定(见表1)。

表1 PCR引物序列

1．5．3 逆转录 按照逆转录试剂盒说明书操作， 产物作为PCR反应的cDNA模板。

1．5．4 PCR扩增 取逆转录产物5μL作为模板进行扩增，反应体系为50μL。PCR反应条件:预变性 94℃，1 min→变性95℃，1 min→退火 c－myc 55℃，1 min→延伸72℃，1 min，共35个循环。

1．5．5 凝胶电泳 取10μl最后PCR产物和βactin的扩增产物经1．5%琼脂糖溴化乙锭染色的凝胶上运行。电泳结果用凝胶成像分析系统进行灰度扫描分析，c－myc mRNA的相对含量以其与β－actin(吸光度×面积)之比值表示。

1．6 统计学处理 应用SPSS 10．0统计软件进行处理，资料为定量正态资料，以平均值±标准差(x±s)表示，采用重复测量的方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2．1 各组大鼠体重的变化 在建模成功后第3天、第7天，DM组的大鼠体重均比Normal组的体重减轻(P＜0.05)，其余各组大鼠体重与Normal组比较无明显变化(见表2)。

表2 各组大鼠体重的变化(x±s)

2．2 各组大鼠血糖水平的变化 在建模成功后第1天、第3天、第7天时，DM组大鼠血糖浓度均显著高于Normal组 (P＜0.01)，Insulin组、Bre组大鼠各时间点血糖浓度均低于DM组(P＜0.01)，但高于Normal组(P＜0.01)(见表3)。

表3 各组大鼠血糖水平的比较(x±s)

2．3 原癌基因c－myc mRNA表达 在建模成功后第3天，DM组大鼠心肌c－myc mRNA表达显著高于Normal组(P＜0.01)，Insulin组或Bre组的大鼠心肌 c－myc mRNA表达均低于 DM组(P＜0.01)，与Normal组比较无明显差异(P＞0.05)。(见图1、表4)

表4 各组大鼠心肌原癌基因c－myc mRNA的表达(x±s)

图1 c－myc与β－actin电泳凝胶成像

3 讨论

依据大量的流行病学、病理解剖学和动物实验及临床研究表明，DCM是一个独立的原发病，是糖尿病心脏病的最早表现，是由糖尿病引起的与血管疾病同时伴行或单独发生的特异性心肌病［1］。而且有研究表明:波动性高糖与单纯性高糖一样，具有促进心肌细胞肥大的作用，对DCM的发展均具有促进作用［2］。DCM主要的病理表现为局灶性心肌坏死、心肌肥大，细胞外基质(ECM)沉积，细小动脉管壁增厚及纤维化，管腔狭窄，心肌纤维化，心室重量/体重比增加［3］。

c－myc是体内编码核内转录因子，参与细胞增殖分化的调控。在新生儿和成年鼠心脏检测出c－myc基因表达，在体外培养的肥大心肌细胞，检测出高表达c－myc基因的mRNA，而c－myc基因过量表达的转基因动物也会诱发心脏大小的增加。有研究表明:高糖可促进原癌基因c－myc和cfos的表达［4］。而活性增强的蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)与细胞内Ca2+超载，二者协同作用可致细胞内c－myc蛋白水平增高。在糖尿病时，PKC是促使正常心肌发生病变的重要媒介，且心肌损伤的程度与PKC增强的活性呈正性相关。高血糖状态下的氧化应激可增强PKC的活性［5］，引起Ca2+超载，离子转运异常，从而影响心肌结构和功能。PKC的活性升高可激活调节原癌基因c－fos、c－jun等的表达，导致心肌纤维化、左心室肥大，左心室收缩及舒张功能减退［6］。

Bre是从灯盏花中提取的黄酮类成分，是灯盏花中发挥心血管作用的有效成分［7］。已有的研究显示，Bre主要扩张血管，降低血管阻力，增加脑、肾等器官血流量，改善微循环，并有抗血小板及红细胞聚集的作用。灯盏花素又是PKC抑制剂，在肾脏灯盏花素可通过抑制PKC活性而阻止高糖环境肾系膜细胞c－fos、c－jun蛋白表达而用于防治糖尿病肾病［8］。本研究应用STZ成功建立糖尿病大鼠模型，结果发现DM组大鼠在第3天、第7天的体重均比Normal组的体重减轻(P＜0.05)，在第1天，第3天、第7天的大鼠血糖浓度均比Normal组高(P＜0.01)，第3天大鼠心肌c－myc基因的mRNA表达增强，而Insulin或Bre可以分别降低血糖水平和下调c－myc基因的mRNA表达。因此，Insulin、Bre可抑制糖尿病心肌原癌基因c－myc的表达，对DCM有一定的保护作用。

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