程旺元，赵 丽，龚汉雨，覃永华，余光辉

(中南民族大学生命科学学院，武汉430074)

气孔是气体进出植物细胞的门户，是光合作用和呼吸作用与外界气体交换的出口，气孔功能性的开关影响着蒸腾、光合、呼吸作用的效率.植物的气孔由一对保卫细胞围成.研究表明，气孔的运动和保卫细胞的结构特点有关［1］.光照、CO2浓度、水分胁迫和温度是影响气孔开闭的主要环境因素.植物生长调节物质如生长素(2，4-D)，细胞分裂素(6-BA)和脱落酸(ABA)等激素信号对拟南芥叶片下表皮气孔的张开和闭合也有明显的影响，不同类型的激素对气孔的调节存在着交互“谈话”(Crosstalk)［2］.

γ-氨基丁酸(GABA)是一种独特的非蛋白质氨基酸，与植物在逆境条件下的应激反应有关［3］.研究表明GABA可作为一种信号分子调节拟南芥生殖发育过程中花粉管的导向生长，影响细胞内Ca2+瞬时变化［4］，同时参与细胞内多种基因的表达调控.但GABA对气孔关闭的调节目前尚未见报道.

本研究以绿色荧光蛋白(GFP)标记的微丝(35S-talin-GFP)转基因植株的下表皮为实验材料，先让气孔全部张开，再用GABA浸润处理，以蒸馏水为对照，以指甲油法观察气孔，探讨了GABA对拟南芥下表皮细胞气孔的闭合的影响作用.

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

电激仪(Eppendorf 36205-20)，超净工作台(SWC-J-A智能型，上海新苗医疗器械制造有限公司)，拟南芥生长恒温温室(中南民族大学生命科学学院).

MS(Murashige and Skoog)培养液(上海科兴贸易有限公司)，γ-氨基丁酸(Sigma公司)，卡那霉素(武汉丁香园生物科技公司).微丝标记的质粒(35S-talin-GFP)由Holweg博士馈赠.

1.2 转化菌株的培养

质粒经大肠杆菌扩增后提取，用电转法将质粒导入LBA4404农杆菌中，经50 μg/mL卡那霉素在固体LB平板上筛选，28℃培养过夜培养.挑取菌落用液体培养后，用于植株转化.

1.3 拟南芥种植和农杆菌转化

拟南芥种子(Columbia基因型)播种于蛭石中，置温室20～22℃培养，相对湿度为60%～70%，光强为16000 lux，16 h和8 h的光暗循环，培养基为MS培养液.待植株生长6周花序长出后剪去其顶生花序，再经4～6 d培养，有更多侧生花序长出后进行转基因操作.转化方法为浸花法［5］，转化时农杆菌的OD值为0.8.

1.4 转化植株的筛选

将浸花法得到的种子经5%的次氯酸钠表面消毒后，播种于含有100 mg/mL卡那霉素的1/2 MS固体培养基上筛选.将子叶颜色深绿的小苗小心转入蛭石中培养，收获种子.再将种子经2轮筛选，得到荧光强的种子进行生理研究.

1.5 转基因植株的荧光观察

用镊子轻轻撕下转基因拟南芥植株的根或叶片的下表皮，放在载玻片上，加入液体MS培养基，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察.

1.6 气孔张开液和GABA处理

气孔张开液的配方参考 Tanaka 方法［1，2］，含KCl 1.0 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，MES 1.0 mmol/L，0.01%Tween20，分别放入 4 个培养皿中，将拟南芥叶片(下表皮朝下)放在气孔张开液中.用指甲油影印法［6］测量气孔张开度，记录处理前气孔的张开率和处理30，60，90，120 min气孔的张开情况.确定气孔张开度达98%以上时，将叶片转入1 mmol/L GABA溶液中，以蒸馏水为对照，观察GABA对气孔张度的影响.

2 实验结果

2.1 转基因拟南芥植株生长情况

35S-talin-GFP质粒含有微丝结合蛋白talin和增强型的绿色荧光蛋白功能原件，在6×35S超强启动子作用下启动基因的表达.在拟南芥细胞中绿色荧光分布的区域为actin分布的区域.用浸花法将35S-talin-GFP质粒转化拟南芥.结果表明35S-talin-GFP质粒的转化效率较高，在F1代种子中(约3.08×104个)筛选到5个绿色幼苗.在F2代中，转化植株幼苗生长正常，和非转化的野生型幼苗无可见的形态区别(见图1)，表明GFP标记的报告基因对植物的生长无影响.

图1 拟南芥的转基因植株(10d龄的幼苗)Fig.1 Transgenic Arabidopsis plants(10 d seedlings)

2.2 GFP标记的Talin的荧光分布

Talin是一种与微丝结合的蛋白，它和GFP共表达显示了与之结合的微丝骨架的存在.为筛选到较强的荧光标记，对获得的转基因阳性植株进行荧光观察.在F2种子萌发试验中，有绿色荧光分布的植株占萌发植株的100%，表明收获的F2均为转基因种子.在根部细胞中，较强的绿色荧光分布在根尖的生长点、伸长区和根毛区(图2A-C)，在荧光图像中几乎看不到细胞的轮廓.这是由于这些区域的细胞体积过小(图2A')，它们发出的荧光相互干扰造成的.在根毛区，GFP的分布呈现极性特点，荧光主要分布在细胞壁周围(图2B、B')，这与微丝分布的特点相一致;在根的伸长区，actin的荧光分布主要位于细胞核周围，靠近细胞壁的位置荧光信号较强(图2C、C'、C″箭头所示)，这是由于成熟细胞中较大的液泡将细胞质骨架压缩至细胞周围.为清晰观察到actin荧光的分布，分离了拟南芥的根部伸长区细胞原生质体，结果表明绿色荧光主要分布在细胞液泡周围的细胞质中(图2D、D')，D为明视野，D'为分离的细胞原生质体.通过对根毛细胞的局部放大，actin细胞骨架除分布在细胞膜周围外，在细胞核周围的荧光信号也较为明显(图2E、E')，表明细胞核骨架的存在.在对叶片下表皮荧光观察中，筛选到了只在气孔保卫细胞表达，而在叶肉细胞中无表达的植株(图2F、F').这一结果有利于观察气孔中微丝对信号响应的变化.

图2 转基因拟南芥植株actin荧光分析Fig.2 Fluorescence distribution assay of actin in transgenic Arabodopsis plants

2.3 气孔张开液对拟南芥叶片下表皮气孔张开的影响

为有效评价GAGA对拟南芥叶片下表皮气孔的作用，用气孔张开缓冲液处理拟南芥叶片下表皮，结果见图3.由图3可见，随着处理时间的延长，气孔张开的百分率随之增加，张开的气孔数逐渐达到饱和.处理2h时，气孔的张开百分率达98%，基本处于曲线的平台期.

2.4 GABA对气孔的张开百分率的影响

用气孔张开缓冲液处理后，将叶片转入含有1.0 mmol/L GABA的溶液中处理，GABA对气孔的张开百分率和气孔的大小的影响见表1.由表1可见，随着处理时间的延长，气孔的张开百分数明显降低.处理30 min后，与蒸馏水处理组相比，GABA组气孔的张开百分数降至约20%.说明GABA信号能显著降低气孔的张开百分数(n=3，每次统计约30个气孔，P＜0.01)，气孔的关闭受到GABA信号的影响.

图3 气孔张开液对气孔张开百分率影响的时间进程Fig.3 Time dependent effect of opening buffer on the percentage of stoma opening

用GABA处理30min后，用测微尺测量气孔大小，发现GABA处理后的气孔的长轴和短轴均明显小于气孔张开液处理组，两者有极显著差异(n=3，P＜0.01);与蒸馏水处理组相比，两者有显著性差异(n=3，P＜0.05).结合GABA对气孔张开百分率的影响分析，说明GABA信号对气孔关闭的诱导是一个快速的过程.

表1 GABA对拟南芥气孔关闭的影响Tab.1 Effect of GABA on Arabidopsis stoma closure

3 讨论

运用转基因技术，可以获得稳定转化的标记细胞骨架的拟南芥植株，与野生型拟南芥相比，转基因的拟南芥在荧光显微镜下表现出较强的荧光.用GFP标记的微管和微丝主要分布在细胞膜的周围区域和细胞核区域，由于成熟细胞的中央为大液泡所占据，将含有细胞骨架的细胞质组分挤向细胞的周围.在幼小的细胞中如根的分生组织细胞，荧光信号较为强烈，是由于细胞荧光信号的相互干扰造成.重要的是实验中筛选到了只在气孔保卫细胞中特性分布的GFP标记的微丝骨架植株，为研究微丝对信号的动态响应提供了很好的研究材料.

实验用气孔张开液处理拟南芥叶片，气孔的张开比例随处理时间的增加而增多，处理2 h，张开比例达到98%，可以认为气孔已经完全张开.经蒸馏水处理后，张开比例降至53.85%;而用GABA处理后，气孔张开率降至20.33%.蒸馏水处理引起气孔关闭是由于叶片被水饱和，表皮细胞含水量高而膨胀，挤压保卫细胞所致;而GABA引起气孔关闭则与其信号传递引起的气孔主动关闭有关.

研究表明，脱落酸(ABA)的低浓度溶液洒在叶表面，可关闭气孔开放达数天，并且作用快，在2～10 min 内可使多种植物气孔开始关闭［1，2］.GABA 作为一种类激素物质，是植物生长发育中的重要信号分子［3，4］，本研究发现了它可使气孔大部分闭合.推测原因之一是GABA作为信号分子，将激素、干旱等外部信号经过细胞膜上的受体或感受器向细胞内进行级联放大(cascade)，最终产生细胞反应.有研究表明，GABA信号可以促进细胞内Ca2+的水平增高［4］，Ca2+可和钙调素蛋白(CaM)结合激活下游的分子事件.拟南芥气孔保卫细胞中有钙调蛋白类基因的表达［6］，而CaM也直接参与了保卫细胞微丝骨架的解聚所引起的气孔关闭过程［7］;另一种可能的分子机制与乙烯信号有关.乙烯参与了其他激素引起的气孔关闭的调节［1，2］.GABA 能促进乙烯的合成［8］，但这两种信号在气孔关闭的调节上是相互协同还是拮抗，值得深入研究.

［1］Tanaka Y，Sano T，Tamaoki M，et al.Ethylene inhibits abscisic acid-induced stomatal closure in arabidopsis［J］.Plant Physiol，2006，140(1):396.

［2］Tanaka Y，Sano T，Tamaoki M，et al.Cytokinin and auxin inhibit abscisic acid-induced stomatal closure by enhancing ethylene production in Arabidopsis［J］.J Exp Bot，2006，57(10):2259-2266.

［3］Shelp B J，Mullen R T，Waller J C.Compartmentation of GABA metabolism raises intriguing questions［J］.Trends Plant Sci，2012，17(2):57-59.

［4］Yu G H，Liang J G，He Z K，et al.Quantum dotmediated detection of γ-aminobutyric acid binding sites on the surface of living pollen protoplasts in tobacco［J］.Chem Biol，2006，13(7):723-731.

［5］Clough S J，Bent A F.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana［J］.Plant J，1998，16(6):735-743.

［6］段瑞君，沈竹夏.一个钙调蛋白类基因对拟南芥叶片气孔分布的影响［J］.云南植物研究，2005，27(4):390-394.

［7］肖玉梅，陈玉玲，黄荣峰，等.拟南芥保卫细胞微丝骨架的解聚可能参与了细胞外钙调素诱导的气孔关闭［J］.中国科学C辑，2004，34(2):129-135.

［8］马兆武，杨旭红，余光辉.γ-氨基丁酸对烟草MAPK和ACS1基因表达的分叉调节［J］.武汉植物学研究，2008，26(5):520-523.