刘 涛，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，华会明

1中国医科大学药学院，沈阳110001;2沈阳药科大学创新药物研究与设计教育部重点实验室，沈阳110016; 3国家海洋局第一海洋研究所，青岛266061;4青岛科技大学，青岛266042

海洋真菌Fusarium sp.次级代谢产物的研究

刘 涛1*，李占林2，王 宇2，田 黎3，4，裴月湖2，华会明2

1中国医科大学药学院，沈阳110001;2沈阳药科大学创新药物研究与设计教育部重点实验室，沈阳110016;3国家海洋局第一海洋研究所，青岛266061;4青岛科技大学，青岛266042

采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、开放ODS柱色谱以及HPLC等方法从海洋真菌Fusarium sp.的菌丝体中分离得到5个化合物，通过波谱数据及理化性质分别鉴定为3β，15β-二羟基-(22E，24R)-麦角甾-5，8(14)，22-三烯-7-酮(1)、3β，5α，9α-三羟基-(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯-6-酮(2)、(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(3)、5α，8α-过氧-(22E，24R)-麦角甾-6，22-二烯-3β-醇(4)和丁二酸(5)。其中化合物1和2首次从该属真菌中分离得到。

海洋真菌;镰孢霉属真菌;次级代谢产物;麦角甾醇

海洋生物总量约占地球生物总量的87%，是一个巨大的生物资源宝库。海洋独特的生态环境造就了其生物的生存及代谢方式的特殊性［1］。

美国国立肿瘤研究所(NCI)，自1986年起将研究重点转向对海洋真菌、蓝细菌以及其它各类型海洋微生物的研究。其研究结果表明，海洋微生物在抗肿瘤药物方面具有巨大的开发价值。近些年来，随着对海洋微生物次级代谢产物研究的不断深入，从海洋真菌中发现了越来越多的抗癌活性物质，而且它们往往具有新颖的结构。海洋真菌次级代谢产物已经成为了一个热点的研究领域。

镰孢霉属(Fusarium)又名镰刀菌属，为半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，瘤座孢目(Tuberculariales)中的一个属，是重要的真菌类群。陆生镰孢霉属真菌是一种常见的植物病原菌［2］。近年来，从海洋来源的镰孢霉属真菌中相继发现了环肽、神经鞘胺醇苷、蒽醌及甾体衍生物等许多结构独特，活性显著的次生代谢产物，引起了人们的广泛关注。为了寻找新的抗癌活性成分，作者对海洋来源镰孢霉属真菌Fusarium sp.菌丝体的丙酮提取物进行了化学成分研究，从中分离得到5个化合物，通过1D和2D NMR以及文献对照等手段鉴定了这些化合物的结构。

1 仪器与材料

Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振仪;日本HITACHI公司L 2130型HPLC，检测器为HITACHI L 2400型;YMC-Pack ODS-AM:10 mm×250 mm;开放ODS柱色谱填料(100 μm，日本YMC公司);Sephadex LH-20为GEhealthcare产品;柱色谱硅胶(200～300目)及薄层色谱硅胶均购于青岛海洋化工厂。所有试剂为分析纯和色谱纯。

海洋镰孢霉属真菌Fusarium sp.于2007年4月分离自南海潮间带红树植物正红树(Rhizophora apiculata)根际泥，由国家海洋局第一海洋研究所，青岛科技大学田黎教授鉴定。菌株编号:HTTM-Z07006，存放于科技部资助的国家海洋局第一海洋研究所药用海洋微生物菌种资源库。

发酵培养基及条件:马铃薯浸汁200 mL，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，葡萄糖17 g，NaCl 15 g，MgCl2· 6H2O 1 g，KCl 0.1 g，FePO40.01 g，水1000 mL，24℃，150 rpm，振荡培养12 d，发酵量60 L。

2 提取分离

发酵液60 L，经多层纱布过滤，分离得到滤液和菌丝体。菌丝体(湿重1906.5 g)经反复“冷冻-融化”处理后，用4倍量丙酮超声提取三次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏81.5 g。浸膏经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)进行梯度洗脱，得到282个流份(500 mL/流份)。第33～55流份合并，经 Sephadex LH-20柱色谱，用氯仿-甲醇(1∶1)进行洗脱，第6-15亚流份合并，经硅胶柱色谱，用石油醚-丙酮(50∶1～7∶2)进行梯度洗脱，得到化合物4(6 mg);第51-57流份合并，经Sephadex LH-20柱色谱，用氯仿-甲醇(1∶1)进行洗脱，第17-19亚流份合并，经开放ODS柱色谱及Sephadex LH-20柱色谱得到化合物1(2 mg);第85～95流份合并，经Sephadex LH-20柱色谱，用氯仿-甲醇(1∶1)进行洗脱，第11～14亚流份合并，经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，所得流份再经过Sephadex LH-20(甲醇洗脱)，HPLC(体积分数30%的甲醇水溶液为流动相，保留时间为75 min)以及开放ODS柱色谱(体积分数为30%～75%的甲醇水溶液梯度洗脱)得到化合物2(2 mg);第96-123流份合并，经Sephadex LH-20柱色谱，用氯仿-甲醇(1∶1)进行洗脱，第12～16亚流份合并，经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇(9∶1，5∶1)梯度洗脱，得到化合物3(3 mg);第124-135流份合并，经Sephadex LH-20柱色谱，用氯仿-甲醇(1∶1)进行洗脱，第16～19亚流份合并，经Sephadex LH-20柱色谱，用氯仿-甲醇(1∶1)进行洗脱，得到化合物5(7 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 无色针状结晶(甲醇)，1H NMR(300 MHz，C5D5N)给出δ 1.09(3H，d，J=6.6 Hz)，1.00 (3H，s)，0.95(3H，s)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz)，0.84(3H，d，J=6.8 Hz)六个甲基质子信号，结合13C NMR(150 MHz，C5D5N)给出28个碳信号，推测该化合物为麦角甾类。δ 5.30(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz)，5.28(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz)为侧链22，23位反式双键相互偶合的特征质子信号。δ 6.04(1H，d，J=1.8 Hz)为一烯氢质子信号，结合碳谱给出的7个碳信号(δ 191.7，171.5，169.6，135.1，132.8，128.7，127.0)，推测结构中含有三个碳碳双键(其中三个为季碳)以及一个羰基，且两个双键与羰基形成共轭体系。氢谱给出δ 4.98(1H，br s)，3.88(1H，m)两个连氧碳上质子信号，结合碳谱中δ 70.3，69.6两个连氧碳信号，推测结构中应该有两个羟基取代。HMBC进一步给出H-15(δH4.98，1H，br s)与C-13(δC45.9)，C-17(δC53.7)，C-8(δC128.7)的远程相关; H-18(δH0.95，3H，s)与C-14(δC169.6)的远程相关，可以确定15-OH及△8(14)的取代位置。根据H-6(δH6.04，1H，d)与 C-10(δC40.1)，C-4(δC42.7)，C-8(δC128.7)存在远程相关以及H-19(δH1.00，3H，s)与C-5(δC171.5)存在远程相关，可确定△5(6)的取代位置。根据△5(6)，△8(14)四个双键碳的化学位移值，推测结构中存在两对α，β-不饱和羰基，因此羰基碳应在C-7位。采用CDCl3重新测试该化合物的1H NMR，H-15化学位移值为δ 4.70(d，J=5.4 Hz)，15-OH化学位移值为5.66，与文献［3］对照确定15位羟基为β构型。根据以上信息并结合文献［3］，确定该化合物结构为3β，15β-二羟基-(22E，24R)-麦角甾-5，8(14)，22-三烯-7-酮［3β，15β-dihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-5，8(14)，22-triene-7-one］。具体 NMR数据归属如下:1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:6.04(1H，d，J=1.8 Hz， H-6)，5.30(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz，H-22)，5.28 (1H，dd，J=15.2，7.9 Hz，H-23)，4.98(1H，br s，H-15)，3.88(1H，m，H-3)，2.82(1H，m，H-4b)，2.69 (1H，m，H-4a)，2.43(1H，m，H-9)，2.18(2H，m，H-16b，20)，2.11(1H，m，H-2b)，2.00(2H，m，H-12b，17)，1.87(1H，m，H-16a)，1.86(1H，m，H-24)，1.78 (1H，m，H-2a)，1.77(1H，m，H-1b)，1.76(2H，m，H-11)，1.45(1H，m，H-25)，1.38(1H，m，H-12a)，1.24 (1H，m，H-1a)，1.09(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，1.00(3H，s，H-19)，0.95(3H，s，H-18)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.84(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)。13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ:191.7(C-7)，171.5(C-5)，169.6(C-14)，135.1(C-22)，132.8(C-23)，128.7(C-8)，127.0(C-6)，70.3(C-15)，69.6(C-3)，53.7(C-17)，47.1(C-9)，45.9(C-13)，43.1(C-24)，42.7(C-4)，40.1(C-10)，38.9(C-20)，37.5(C-16)，35.7(C-12)，35.6 (C-1)，33.3(C-25)，32.0(C-2)，19.4(C-11)，21.8 (C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，19.5(C-18)，18.8(C-19)，17.8(C-28)。

化合物2 白色无定形粉末，1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:8.62(1H，s，5-OH)，6.28(2H，br s，3-OH and 9-OH)，5.93(1H，d，J=2.1 Hz，H-7)，5.27(1H，dd，J=15.3，7.2 Hz，H-23)，5.17(1H，dd，J=15.3，7.2 Hz，H-22)，4.64(1H，m，H-3)，1.15 (3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.95 (3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)。13C NMR(75 MHz，C5D5N)δ:199.1(C-6)，164.1(C-8)，135.2(C-22)，132.4(C-23)，120.3 (C-7)，79.8(C-5)，75.0(C-9)，66.8(C-3)，56.1(C-17)，52.0(C-14)，45.3(C-13)，43.1(C-24)，42.2 (C-10)，40.6(C-20)，38.2(C-4)，35.5(C-12)，33.3 (C-25)，31.5(C-2)，29.0(C-11)，28.4(C-16)，26.4(C-1)，22.7(C-15)，21.3(C-21)，20.4(C-19)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，17.9(C-28)，12.4(C-18)。以上数据，经与文献［4］对照确定该化合物结构为3β，5α，9α-三羟基-(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯-6-酮［3β，5α，9α-trihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one］。

化合物3 无色针状结晶(氯仿-甲醇)，1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:5.74(1H，m，H-7)，5.25 (1H，dd，J=15.0，6.9 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J= 15.0，6.9 Hz，H-23)，4.83(1H，m，H-6)，4.32(1H，m，H-3)，1.53(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.94(3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.85 (3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.65(3H，s，H-18)。13C NMR(75 MHz，C5D5N)δ:141.5(C-8)，136.1(C-22)，132.1(C-23)，120.5(C-7)，76.1(C-5)，74.3(C-6)，67.6(C-3)，56.1(C-17)，55.2(C-14)，43.7(C-9 and C-13)，43.0(C-24)，42.0(C-4)，40.9(C-20)，39.9(C-12)，38.1(C-10)，33.8(C-2)，33.3(C-25)，32.7(C-1)，28.5(C-16)，23.5(C-15)，22.4(C-11)，21.4(C-27)，20.1(C-26)，19.8(C-21)，18.8(C-19)，17.8 (C-28)，12.5(C-18)。以上数据，经与文献［5］对照确定该化合物结构为(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇［(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol］。

化合物4 无色针晶(乙酸乙酯)，1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ:6.50(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，6.24 (1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，5.20(1H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-23)，3.97(1H，m，H-3)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.90(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.88(3H，s，H-19)，0.83(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.82(3H，s，H-18)，0.81(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:135.4(C-22)，135.2(C-6)，132.3(C-23)，130.7(C-7)，82.1(C-5)，79.4(C-8)，66.4(C-3)，56.2(C-17)，51.6(C-14)，51.0(C-9)，44.5(C-13)，42.7(C-24)，39.7(C-20)，39.3(C-12)，36.9 (C-4 and C-10)，34.7(C-1)，33.0(C-25)，30.1(C-2)，28.6(C-16)，23.4(C-11)，20.9(C-21)，20.6(C-15)，19.9(C-27)，19.6(C-26)，18.2(C-19)，17.5 (C-28)，12.8(C-18)。以上数据，经与文献［6］中数据对照基本一致，故鉴定该化合物为5α，8α-过氧-(22E，24R)麦角甾-6，22-二烯-3β-醇［5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol］。

化合物5 无色针状结晶(氯仿-甲醇)，溴甲酚绿反应阳性。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:12.13 (2H，s，COOH)，2.42(4H，s，CH2)。综上分析，鉴定该化合物为丁二酸(amber acid)。

本文报道的化合物主要为麦角甾类化合物。根据文献报道，化合物1对小鼠白血病细胞P388和人白血病细胞HL-60均具有较强的抑制活性［3］;化合物2对小鼠肝癌细胞具有抑制作用［7］;化合物4对小鼠乳腺癌细胞tsFT210具有中等强度的细胞毒活性［8］。

甾体化合物是一类重要的天然有机化合物，广泛存在于生物有机体内。到目前为止，从海洋微生物次级代谢产物中发现新的甾体化合物数量较少，但有报道称很多从海绵等海洋生物中发现的甾体化合物很可能是其附生的微生物的代谢产物。最近研究表明很多来源于海洋微生物的甾体类化合物都具有较强的细胞毒活性，具有十分重要的研究与开发价值，其作用机制更是有待于进一步研究。

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Secondary Metabolites from Marine Fungus Fusarium sp.

LIU Tao1*，LI Zhan-lin2，WANG Yu2，TIAN Li3，4，PEI Yue-hu2，HUA Hui-ming21School of Pharmaceutical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China;2Key Laboratory of Structure-Based Drug Design＆Discovery，Ministry of Education，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;3The First Institute of Oceanography SOA，Qingdao 266061，China;4Qingdao University of Science＆Technology，Qingdao 266042，China

Five compounds were isolated and purified from the mycelia of marine fungus Fusarium sp.by using silica gel，Sephadex LH-20，open ODS column chromatography and HPLC.On the basis of spectral data and physicochemical properties，their structures were elucidated as 3β，15β-dihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-5，8(14)，22-triene-7-one(1)，3β，5α，9α-trihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one(2)，(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol (3)，5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol(4)，and amber acid(5).Compounds 1 and 2 were isolated for the first time from this genus of marine fungus.

marine fungus;Fusarium sp.;secondary metabolite;ergosterol

1001-6880(2012)08-1047-04

2011-08-30 接受日期:2011-11-24

国家自然科学基金(20872094);国家863项目(2007AA09Z413，2007AA09Z435)

*通讯作者 Tel:86-24-23256666-5239;E-mail:lnliutao@yahoo.com.cn

R931.77

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