邱志东，范琳峰，雷长江，缪辉来

（广东医学院附属医院 肝胆外科，广东 湛江524001）

胰腺癌是一种恶性程度高，进展迅速，手术切除率低，预后极差的恶性肿瘤，本文从表观遗传学的角度研究Runx3基因在胰腺癌细胞中失表达的机制，以期为胰腺癌的早期诊断及新的治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）细胞株：Panc－1、BxPC－3、AsPC－1三种胰腺癌细胞株（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）；（2）主要试剂：DMEM 培养基、RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），TRIZOL总RNA提取试剂盒、PrimeScript OneStep RT－PCR Kit Ver.2（大连宝生物公司）、One step sybr primescripttmrtpcr kitⅡ（大连宝生物公司），EZ DNA甲基化试剂盒－direct、Zymo Taqtm PreMix（美国 ZYMO RESEARCH公司），引物、内参（上海生物工程公司、大连宝生物公司），Western封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、一抗二抗去除液、鼠抗人GADPH抗体（碧云天生物技术研究所），小鼠抗人Runx3单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology）。

1.2 方法

（1）细胞培养。（2）RT－PCR检测 Runx3基因的表达：①癌细胞株及胰腺组织中RNA的抽提；②引物序列及产物长度：Runx3上游引物为5′－AGGCATTGCGCAGCTCAGCGGAGT－3′，Runx3 下游 引 物 为 5′－AGGCATTGCGCAGCTCAGCGGAGTA－3′，扩增长度为152bp，β－actin上游引物为 5′－TGGCACCCAGCACAATGAA－3′，β－actin下游引物 为 5′－CT AAGTCATAG TCCGCCTAGAAGCA－3′，扩增长度为186bp，引物均由上海生工合成，引物离心后用0.1%DEPC处理水稀释至所需浓度，－20℃保存；③参照TaKaRa公司的onestep RT－PCR Kit使用说明书进行RT－PCR；④琼脂糖凝胶电泳和图象分析。（3）Westren blotting：①样品制备；②蛋白定量；③SDS－PAGE电泳；④转膜；⑤封闭及抗原抗体反应；⑥化学发光显影、定影及图像分析。（4）甲基化特异PCR：①细胞计数；②贴壁细胞DNA提取；③正常胰腺组织中提取DNA；④引物设计及扩增长度，Runx3基因的甲基化特异性PCR引物用Methprimer软件设计，甲基化引 物 （M）上 游 为：5′－CGTCGGGTTAGCGAGGTTTC－3′，下游为：5′－GCCGCTACCG CGAAAAACGA－3′，扩增长度120bp；非甲基化引物（U）上游为：5′– GTGGGTGG TTGTTGGGTTAGT－3′，下游 引 物 为：5′－TCCTCAACCACCACTA CCACA－3′，扩增长度为138bp，引物均由上海生工合成。……