单士刚,包永芬

(湖北科技学院基础医学院,湖北 咸宁 437100)

有害性多环芳烃化合物,如苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]是普遍存在的环境污染物,主要来源于香烟和含碳有机物的不完全燃烧.B(a)P不仅对机体呼吸系统有影响,而且还可以损伤免疫系统,对人类健康的影响主要表现在遗传损伤、致癌和免疫毒性等[1].目前认为B(a)P对机体的损伤可能与代谢和细胞毒性之间有一定的关系.其中重要的途径可能是代谢活化、引发自由基和氧化应激以及干扰细胞第二信号传导网络的正常运行等,从而影响细胞的活性,最终导致机体的损伤[2-4].本实验以体外培养的淋巴细胞株为研究对象,不同浓度B(a)P(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)染毒16 h,分别用MTT(四甲基氮唑蓝,methylthiazolyltetrazolium)法、Elisa和Western blot法检测淋巴细胞细胞活力、细胞因子分泌以及热休克蛋白70(heat shock proteins70, HSP70)表达情况,为今后评估人群接触B(a)P对免疫系统的毒性和应激作用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1细胞株和试剂人B细胞转化淋巴母细胞系721.221购自武汉大学中国典型培养物保藏中心.胎牛血清、RPMI-1640培养基均为美国Gibco公司产品；MTT和B(a)P购自美国Sigma公司；IFN-α、interleukin-1α和interleukin-6 ELISA试剂盒(Pierce,美国),鼠抗人单克隆HSP70,鼠抗人β-actin单克隆,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG (武汉博士德公司),其他试剂为国产分析纯.

1.2细胞培养与染毒721.221细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置含5%CO2的37 ℃培养箱内培养.取对数生长期721.221细胞,设不同浓度的B(a)P染毒组(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)、溶剂对照组(1‰DMSO, 3‰S9)和空白对照组(含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基).

1.3MTT试验取对数生长期721.221细胞,以每孔5.5×103个细胞接种于96孔培养板.设不同浓度的B(a)P 染毒组(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)、溶剂对照组(1‰DMSO, 3‰S9)和空白对照组(含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基).每组设6个复孔,培养箱中培养12 h.取出培养板,每孔加入20 μL MTT(终浓度为0.05 mg/mL),继续培养4 h；取出培养板于1 800 r /min离心10 min,弃去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min至形成的紫色结晶完全溶解,在570 nm处测定吸光度(OD值),按以下公式计算细胞生长率,以反映细胞的增殖活性.

相对光密度值(ROD)=OD实验组/OD对照组×100%

1.4细胞因子的检测取2×106个细胞,加入不同浓度的B(a)P (0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L),设溶剂对照组(1‰DMSO, 3‰S9)和空白对照组(含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基).每组设6个复孔.共同作用16 h后收集培养基上清,按照操作说明书用IFN-α、IL-1α和IL-6 ELISA试剂盒检测.

1.5Westernblot法检测HSP70蛋白表达水平收集处理后的721.221细胞,用冰裂解液裂解细胞,以Lowry 法进行总蛋白定量,50 μg样品与上样缓冲液混和,于8% SDS-PAGE中进行电泳,转印至PVDF膜(孔径0.45 μm).用含5%脱脂奶粉的缓冲液 (Tris-Buffered Saline Tween-20,TBST)封闭,37 ℃孵育1 h.TBST洗3次,10 min/次.鼠抗人HSP70用含5%脱脂奶粉的TBST按1∶400稀释,鼠抗人β-actin单克隆抗体用含5%脱脂奶粉的TBST按1∶1 000稀释,4 ℃孵育过夜.TBST洗涤3次,10 min /次；HRP标记羊抗鼠IgG用含5%脱脂奶粉的TBST按1∶1 000稀释,37 ℃孵育1 h,TBST洗涤.用ECL检测蛋白的表达,凝胶成像系统照相保存.

2 结果

2.1细胞的增殖活性图1可见,与溶剂对照组比较,0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L B(a)P染毒组细胞的增殖活性均升高,差异有统计学意义(P<0.05).且随着B(a)P染毒浓度的升高,细胞的增殖活性呈先上升后下降的趋势,1.000 μmol/L B(a)P染毒组细胞的增殖活性达到峰值,与溶剂对照组相比,增加了40%.

图1 不同浓度B(a)P处理细胞16 h的生长曲线与溶剂对照组比较, * P< 0. 05.

2.2细胞因子检测由图2(A、B)知,细胞经过B(a)P处理后,IL-1α和IL-6分泌随着染毒浓度的增加而降低,与对照组相比有统计学意义(P< 0.05),呈现剂量-效应关系.由图3知,细胞经过B(a)P处理后,低浓度时IFN-α分泌随着染毒浓度的增加而增加,与对照组相比有统计学意义(P< 0.05),呈现剂量-效应关系,且随着B(a)P染毒浓度的升高,IFN-α分泌呈先上升后下降的趋势,1.000 μmol/L B(a)P染毒组分泌达到峰值,随后降低.

图2 不同浓度B(a)P处理细胞16 h后的IL-1α(A)、IL-6(B)分泌情况与溶剂对照组比较, *P<0.05.

2.3B(a)P染毒对721.221细胞HSP70表达的影响如图4所示,不同剂量B(a)P(终浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)作用细胞16 h后,与溶剂对照组相比,低浓度时HSP70表达随浓度增加而增加,1.000 μmol/L达到最大值,随后降低,呈剂量依赖性.

图3 不同浓度B(a)P处理细胞16 h后的IFN-α分泌情况(与溶剂对照组比较, *P<0.05)

图4 不同浓度B(a)P对淋巴细胞HSP70表达的影响(μmol/L)

3 讨论

B(a)P是一种广泛存在于环境中的具有致癌作用的多环芳烃类化合物.自Stijernsward[5]发现其对小鼠体液免疫功能有抑制作用以来,国内外学者对B(a)P的免疫毒性进行了大量的研究,结果表明B(a)P不仅具有明显的体液免疫毒性,而且也有一定的细胞免疫毒性[6-9],从而影响细胞的正常功能.

热应激蛋白(heat stress proteins, HSPs)是机体在各种应激因素(高温、毒物、缺血、缺氧等)作用下, 启动热应激蛋白基因,选择性合成的一组高度保守的蛋白质；其中HSP70是人们研究比较深入的一种蛋白质,它能保护机体细胞免受应激因素的损害,赋予细胞或生物从各种应激中恢复的能力和保护它们免遭这些应激因素的损害[10].细胞实验和流行病学研究表明HSP70蛋白表达水平与DNA损伤有较强的负相关性[11-12].

本研究重点阐述了B(a)P对体外培养淋巴细胞细胞因子分泌和HSP70表达的影响,可为研究B(a)P对机体免疫毒理学和对机体应激系统的影响提供重要的实验依据.本研究发现,与溶剂对照组比较,低剂量时(0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L)细胞的增殖活性均升高,差异有统计学意义(P<0.05)；且随着B(a)P染毒浓度的升高,细胞的增殖活性呈先上升后下降的趋势,1.000 μmol/L B(a)P染毒组细胞的增殖活性达到峰值,与溶剂对照组相比,增加了55%,差异有统计学意义(P<0.05).随着染毒剂量(2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)的增加,B(a)P显著抑制细胞活力.细胞经过B(a)P处理后,IL-1α和IL-6分泌随着染毒浓度的增加而降低,与对照组相比有统计学意义(P< 0.05),呈现剂量-效应关系.低浓度时IFN-α分泌随着染毒浓度的增加而增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05),呈现剂量-效应关系；且随着B(a)P染毒浓度的升高,IFN-α分泌呈先上升后下降的趋势,1.000 μmol/L B(a)P染毒组分泌达到峰值,随后降低.本研究发现随着B(a)P染毒浓度的升高,HSP70的表达呈现先升高后降低的趋势,结果提示B(a)P在低浓度时可以引起细胞的应激体系,降低B(a)P对细胞造成的损伤,高剂量时B(a)P对淋巴细胞DNA造成不可修复的损伤,从而抑制HSP70的表达,这和文献报道[11-12]的生物体在接触一般毒物应激时HSP70表达水平与DNA损伤有较强的负相关性.总之,本实验结果表明B(a)P高剂量时不仅对细胞活力产生抑制作用,同时也通过影响细胞因子的分泌,从而影响免疫细胞的正常生理功能,导致机体免疫功能紊乱,促进肿瘤的发生,并且通过影响机体应激系统,促进肿瘤的发生.但是B(a)P如何通过影响免疫细胞的应激系统,可能导致细胞因子分泌变化的机制有待研究,从而为进一步阐明B(a)P对机体免疫损伤提供依据.

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