田燕，卢瑞春，郁金泰，谭兰

（青岛市市立医院神经内科，山东 青岛 266071）

阿尔茨海默病（AD）是一种病因不明的进行性神经系统变性疾病，根据发病年龄（以65岁为界）分为早发性AD和迟发性AD（LOAD）。AD的发病与遗传变异有关的观点已经得到广泛认可［1］。载脂蛋白E（Apo E）ε4等位基因是目前已经被证实的AD的独立危险因素之一，但携带此等位基因的病人仅占38%［2］。因此，发现更多的遗传基因标记均对诊断和治疗AD是非常有必要的。淀粉样β蛋白诱导补体系统激活在AD发病中发挥重要作用。补体受体1（CR1）被认为有助于清除淀粉样β蛋白。最近有研究结果表明，CR1的基因多态性是否与高加索人的LOAD有关［3］。但是，CR1基因多态性与汉族人LOAD有关尚需研究证实。本研究旨在探讨CR1基因多态性与LOAD发病的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

LOAD组254例为2006年9月—2010年10月我科的住院痴呆病人，其中男118例，女136例；平均年龄（78.4±6.7）岁；发病年龄为（72.6±6.8）岁。LOAD诊断均符合美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会（NINCDS－ADRDA）的标准。均排除了其他神经系统退行性疾病，无AD及精神病家族遗传史。对照组357例为来自我院体检门诊的健康人，其中男161例，女196例；平均年龄（78.7±6.4）岁。均无记忆和智能障碍，MMSE评分＞28；临床及实验室检查均正常；均无自身免疫疾病、糖尿病、心肌梗死、哮喘及脑卒中病史。两组均为中国北方汉族人。此项研究获得研究对象的同意及伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 基因提取 采集外周血5 mL，ACD抗凝，采用苯酚－氯仿法提取基因。

1.2.2 CR1基因多态性检测 引物的设计和合成由上海生工公司完成。rs6656401引物序列：上游引物，5′－ACGTTGGATGGCTTGTAGATGCATCATTTCC－3′；下游引物，5′－ACGTTGGATGGACAGAAGAGCAAAGGACAC－3′；扩增引物，5′－ACACACAGAGGAGAAGGCGA－3′。rs3818361引物序列：上游引物，5′－ACGTTGGATGAAAGGACAGTTCCAGAGCAC－3′；下游引物，5′－ACGTTGGATGTTTTAAGCCCTCTGGTAAGC－3′；扩增引物，5′－CCTCTGGTAAGCATAAGATATA－3′。PCR参数为95℃15 min；95℃5 s、56℃20 s、72℃30 s，共50个循环；72℃30 s［4］。

1.2.3 Apo E基因型检测 引物序列为：5′－ACAGAATTCGCCCCGGCCT GGTACAC－3′和5′－TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA－3′。PCR 参数为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、70 ℃1 min，共30个循环；70℃5 min［5］。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，银染后Gel－Doc 2000下照相分型。

1.3 统计学处理

用H WJ软件进行Hardy－Weinberg平衡估计，其他统计分析用SPSS 11.5软件完成。用直接计数法计算等位基因和等位基因型频率，各组间基因型和等位基因频率比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 各基因组Hardy－Weinberg平衡吻合度检测

除LOAD组rs6656401以外，对照组和LOAD组病人中其他SNP位点的基因型分布均符合Hardy－Weinber g平衡法则（P＞0.05）。

2.2 两组临床特征比较

LOAD组和对照组的年龄、性别无明显差异（P＞0.05）。LOAD 组携带 Apo Eε4等位基因者120例，对照组携带Apo Eε4等位基因者84例，携带Apo Eε4等位基因可增加LOAD的发病风险（χ2＝5.52，P＜0.05，OR＝2.91，95%CI＝2.06～4.12）。

2.3 两组rs6656401和Apo E等位基因和基因型频率分布

LOAD组与对照组CR1基因rs6656401的基因型和等位基因频率差异有显著意义（χ2＝6.56、7.16，P＜0.05），等位基因A显著增加了LOAD的发病风险（OR＝2.60，95%CI＝1.13～5.98）。这一显著性差异在非Apo Eε4携带者中依然存在（χ2＝11.78、11.58，P＜0.05），而在 Apo Eε4携带者中则未发现两组间rs6656401基因型和等位基因频率差异有显著性（P＞0.05）。见表1～3。

表1 两组rs6656401等位基因和基因型频率分布（例（χ／%））

表2 两组ApoEε4携带者rs6656401等位基因和基因型频率比较（例（χ／%））

表3 两组非ApoEε4携带者rs6656401等位基因和基因型频率比较（例（χ／%））

2.4 两组CR1基因rs3818361基因型和等位基因频率分布

LOAD组与对照组CR1基因rs3818361基因型和等位基因频率差异无显著性（P＞0.05）。然而，将该位点经是否携带Apo Eε4分层后，发现非Apo Eε4携带者中两组等位基因频率差异有显著性（χ2＝4.45，P＜0.05，OR＝1.38，95%CI＝1.02～1.87）。见表4～6。

表4 两组CR1基因rs3818361基因型和等位基因频率比较（例（χ／%））

表5 两组ApoEε4携带者CR1基因rs3818361基因型和等位基因频率比较（例（χ／%））

表6 两组非ApoEε4携带者CR1基因rs3818361基因型和等位基因频率比较（例（χ／%））

2.5 LOAD多因素Logistic回归分析

经过性别、年龄和Apo E调整以后，CR1基因rs6656401等位基因A携带者（基因型AA和AG）较基因型GG纯合子导致LOAD的风险高2.40倍（OR＝2.40，95%CI＝1.00－5.73）。而rs3818361基因型TT和CT与CC间的差异则无显著性（P＞0.05）。

2.6 对这两个位点可能组合的单倍型分析

AT单倍型在LOAD组出现的频率高于对照组（χ2＝4.70，P＜0.05，OR＝2.44，95%CI＝1.06～5.62）。见表7。

表7 两组单倍型频率比较（例（χ／%））

3 讨 论

3.1 Apo E基因与LOAD

业已证实，Apo Eε4等位基因被认为是LOAD发病的易感基因［6］，本研究结果也证实了这一点。但是，Apo Eε4等位基因仅占LOAD发病独立危险因素的40%～50%［7］。国内外的研究不仅证实此等位基因是LOAD的遗传易感基因，而且证实其与其他一些遗传易感基因存在相互作用［8］。目前，Apo Eε4等位基因已经成为LOAD遗传研究的基本参量［9］。

3.2 CR1基因与LOAD

Aβ是一种异质的分子结构，能够激活补体系统并与C3b结合。曾经有研究认为，β蛋白诱导补体激活是AD的重要发病机制［10］。已经有研究发现转基因鼠过度表达C3能减少Aβ的沉积和病理作用［11］。相反，抑制C3转化酶的表达则加速Aβ的沉积和神经退行性改变［12］。Aβ通过C3b介导与红细胞表面的CR1相结合，并最终被红细胞清除出循环系统。而CR1作为补体的调节剂主要存在于外周血细胞的细胞膜中。CR1还存在于外周神经有髓鞘纤维的施万细胞内，并推测其通过限制补体激活而阻止有髓鞘纤维脱髓鞘改变［13］。有研究发现，可溶性的CR1具有治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病的作用。因此，我们推测CR1在AD发病中具有保护作用。

虽然本研究中rs3818361和rs6656401位点均位于CR1的内含子中不能直接参与调整蛋白的表达，但是此内含子基因的突变可能通过影响CR1基因的表达而导致LOAD的发病。

最近 LA MBERT 等［3］的研究结果显示，CR1的基因多态性是高加索人患AD的重要基因危险因素，rs6656401和rs3818361的等位基因是LOAD发病的危险因素，尤其是rs6656401。另外一项基因组研究显示，rs3818361是欧洲和美洲人群发生AD的危险因素［14］。本研究结果显示，rs6656401基因多态性与LOAD发病有关，rs6656401的A等位基因与G等位基因联合能增加LOAD的发病风险，此结论与LA MBERT等的研究结论相一致。但本研究未显示rs3818361的等位基因与LOAD发病有关。LOAD组与对照组CR1基因rs3818361基因型和等位基因频率分布也没有显著性差异。用是否携带Apo Eε4分层后，发现非Apo Eε4携带者中LOAD组rs6656401的A等位基因和rs3818361的T等位基因出现的频率较对照组高。这些情况均与LA MBERT等的研究结果不同，考虑可能与种族不同有关。本研究结果还表明，AT单倍型是LOAD发病的危险因素。

综上所述，CR1基因突变可能通过影响Aβ的清除而导致LOAD发病，rs6656401的A等位基因是汉族人患LOAD的重要危险因素。

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