金鑫，姚良苹，卢云，李昌生

（1 枣庄矿业集团中心医院普外科，山东 枣庄 277011； 2 青岛大学医学院附属医院肝胆外科； 3 潍坊寿光市人民医院）

原发性肝癌（HCC）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一［1］。多数病人常伴有不同程度的肝硬化，难以承受手术切除或经动脉化学栓塞治疗，且全身化疗毒副作用大。因此，尽管近年来HCC的综合治疗有了很大的进展，但总的说来HCC病人的预后还是没有明显的改善。随着人们对肿瘤细胞生物学和分子生物学研究的不断深入，基因治疗已经成为21世纪肿瘤治疗的新方法。本实验采用康莱特作用于人肝癌Hep G2细胞，通过检测Hep G2细胞抑制率及其凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）和存活素（Survivin）的表达情况，初步探讨康莱特在基因水平诱导Hep G2肝癌细胞凋亡的机制。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料及其来源

Hep G2肝癌细胞株购自中国科学院上海细胞库，为贴壁细胞。RPMI－1640培养基和二甲基亚砜（DMSO）均购自美国GIBCO公司。细胞凋亡检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。Mouse Ig G1／Ig G1和FITC／PE试剂盒购自北京市晶美基因谷科技有限公司。Caspase－3鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnol ogy公司。Survivin鼠抗人单克隆抗体购自R＆D Systems Inc。

1.2 Hep G2肝癌细胞的培养

贴壁Hep G2肝癌细胞用含体积分数0.10标准胎牛血清的细胞培养基RPMI－1640培养至对数生长期，待80%细胞汇合后，加入2.5 g／L的胰蛋白酶液1～2 mL消化，反复吹打瓶底壁细胞，形成细胞悬液；吸取1／20细胞悬液，接种于新的培养瓶内并加入适量新鲜培养液；放入培养箱中继续培养。

1.3 MTT法检测Hep G2细胞抑制率

取对数生长期细胞移入96孔培养板，细胞密度1×108／L，每孔加细胞悬液200μL。培养箱中培养24 h后，吸弃孔内原培养液，加含体积分数0.005、0.010、0.015、0.020康莱特注射液的 RPMI－1640培养液200μL。各药物分别设4个平行复孔，另设1个空白对照孔。分别培养12、24、48 h，每孔加入5 g／L MTT液20μL。继续培养4 h后终止培养，弃上清液，加入DMSO 150μL终止反应。采用酶标仪于490 n m波长处测定吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）＝（1－A药物／A对照）×100%。

1.4 流式细胞仪测定细胞凋亡情况

调节细胞密度为1×108／L，并置于6孔培养板中。培养24 h后弃上清液，用含体积分数0.005、0.010、0.015、0.020的康莱特体外培养 Hep G2细胞，每种浓度设平行4孔（即每种浓度重复4次），继续培养24 h后收集细胞，并设空白对照。用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其密度为1×109／L；取100μL的细胞悬液置于5 mL流式管中，加入Annexin V／FITC 5μL和20 mg／L碘化丙锭溶液10μL；混匀后于室温避光孵育15 min；在反应管中加PBS 400μL，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 流式细胞仪检测Caspase－3和Survivin表达

调节细胞密度为1×108／L，并置于6孔培养板中；培养24 h后弃上清液，分别加入含体积分数0.005、0.010、0.015、0.020康莱特注射液的 RPMI－1640培养液200μL，每种浓度设平行4孔（即每种浓度重复4次），并设空白对照；继续培养48 h后收集约1010／L细胞到流式管内，离心5 min；弃去上清液，PBS重悬细胞，使其密度为1010／L，加入终止液孵育10 min；康莱特组加入Caspase－3和Survivin荧光抗体均为20μL，对照组加入同型对照Mouse Ig G1／Ig G1和FITC／PE 20μL，置于避光的冰盒内震荡孵育30 min；每管加2 mL PBS，2 000 r／min离心10 min，取上清液500μL，以40 g／L多聚甲醛重悬。流式细胞仪检测Caspase－3和Survivin表达。

1.6 统计分析

2 结 果

2.1 康莱特对肝癌细胞Hep G2增殖的抑制作用

同一时间下，随着康莱特剂量升高，其细胞生长抑制率显著升高，组间比较差异有显著性（P＜0.01）；同一剂量下，随着康莱特作用时间延长，其细胞生长抑制率显著升高，不同时间点比较差异有显著性（P＜0.01）。见表1。

表1 不同浓度康莱特对肝癌细胞Hep G2抑制率的影响（χ／%，±s）

表1 不同浓度康莱特对肝癌细胞Hep G2抑制率的影响（χ／%，±s）

组别 时间（t／h）12 24 48对 照 组 1.37±0.43 17.05±3.09 18.09±2.06康莱特组0.005 15.85±1.35 24.20±2.84 30.89±1.55 0.010 28.31±1.68 37.12±2.22 49.91±2.03 0.015 37.35±3.11 45.72±1.70 60.78±3.31 0.020 51.12±3.30 58.57±4.56 73.73±5.71

2.2 Hep G2细胞凋亡及Caspase－3、Survivin蛋白的表达

随着康莱特剂量的增加，其细胞凋亡率逐渐升高（P＜0.01）。体积分数0.005、0.010、0.015、0.020康莱特组Hep G2细胞Caspase－3、Survivin蛋白表达水平与对照组比较，差异均有显著性（P＜0.01）。见表2。

表2 康莱特诱导Hep G2细胞凋亡及对Caspase－3和Survivin表达的影响（χ／%，±s）

表2 康莱特诱导Hep G2细胞凋亡及对Caspase－3和Survivin表达的影响（χ／%，±s）

组别 细胞凋亡率 Caspase－3 Survivin对 照 组 9.21±0.22 0.48±0.16 13.51±1.20康莱特组0.005 17.98±0.91 1.34±0.21 11.93±0.88 0.010 21.95±1.48 2.58±0.13 9.98±0.67 0.015 23.32±2.72 3.74±0.19 8.89±0.92 0.020 30.32±3.63 4.69±0.24 8.01±0.74

3 讨 论

肝细胞性肝癌为最常见的肝脏恶性肿瘤，特别是在东亚地区尤其明显［2］。近些年来，人们已经逐渐认识到肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控、分化异常的结果，而且与细胞凋亡失衡有关［3］。

实验结果表明，康莱特的作用主要是阻滞细胞周期G2＋M时相，从而减少细胞有丝分裂，使肿瘤细胞的增殖受到抑制，并可激活某些促细胞凋亡发生因子，进一步导致细胞凋亡［4］。已有的研究结果表明，该制剂对多种肿瘤细胞有显著的抑制作用［5］。本研究结果也显示，康莱特不仅能够有效抑制肝癌细胞增殖，呈现浓度、时间依赖性，而且还能诱导细胞凋亡，促使Caspase－3蛋白表达增加，Survivin蛋白表达减少。

众所周知，Caspase－3为与细胞凋亡密切相关的蛋白酶家族，其抑制作用与其浓度密切相关。目前认为Caspase－3是Caspase家族中引发细胞凋亡蛋白酶级联反应中的“核心”。该蛋白可切割染色体DNA，直接导致细胞凋亡，也可以裂解特异性的天冬氨酸底物，诱导细胞凋亡蛋白酶级联反应［6］。同时，某些基因如抑制凋亡蛋白（IAPs）家族则能够通过影响Caspase－3的激活，对细胞凋亡起调控作用。

Survivin是新近发现的IAPs家族成员之一，被认为是迄今发现的最强的细胞凋亡抑制因子，其具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和调节细胞有丝分裂的重要作用［7］。它在胚胎发育过程中出现，在终末分化的成人组织和癌旁正常组织中无表达（胸腺除外），而在转化细胞株和人体内几乎所有的恶性肿瘤中均有明显表达，且其表达还与肿瘤的发生和发展、组织分化程度以及预后均密切相关，是许多肿瘤预后影响因子之一［8］。SHIN 等［9］的研究结果表明，Survivin主要通过抑制Caspase级联反应下游共同通路中的Caspase－3和Caspase－7发挥其抗细胞凋亡作用。

本实验结果显示，随康莱特浓度的增加，Survivin蛋白表达显著抑制，Caspase－3蛋白的表达显著增高，Hep G2细胞凋亡也明显升高。其原因可能是：康莱特一方面直接激活Caspase－3基因，促进Caspase－3蛋白的表达，引起细胞凋亡；另一方面通过抑制Survivin蛋白的表达，从而降低Survivin对Caspase－3的负调节作用，间接促进Hep G2细胞凋亡。现阶段研究表明，Survivin可能通过以下机制影响Caspase－3的表达：Survivin直接抑制Caspase－3、Caspase－7，从而阻断细胞凋亡过程；Survivin结合周期蛋白激酶CDK4，间接抑制Caspase－3活性，阻碍线粒体释放细胞色素C，进而阻断细胞凋亡；Survivin通过Thr［34］位点磷酸化来调节Caspase的促细胞凋亡作用［10］；Survivin与第二个线粒体源的Caspase激活物（SMAC）结合保护IAPs对Caspase的抑制作用［11］。

现已知Survivin的表达呈细胞周期依赖性，即于S期表达增强，G2／M期达到最高水平，而G0／G1期表达下调，且在G2／M期时，高表达的Survivin与Caspase－3、Caspase－7一起定位于中心体微管上，可以防止Caspase－3、Caspase－7被激活而引起细胞凋亡。因此，干扰Survivin和微管蛋白的反应，可致Survivin抗凋亡活性丧失，细胞 G2／M 期凋亡［12］。本实验提示，康莱特干预后，可能通过影响Survivin周期依赖性表达的差异，阻滞肝癌细胞的G2＋M期，间接引起Hep G2细胞凋亡。

总而言之，本实验结果显示，康莱特作用后，随着Survivin表达减弱，Caspase－3表达增强，细胞增殖抑制，细胞凋亡率增高。提示康莱特可能通过干预Survivin的表达，减弱其对Caspase－3的负调控作用，或直接激活Caspase－3来影响肝癌细胞的增殖与凋亡，但具体的作用机制尚需进一步探索。

［1］吴阶平，裘法祖.黄家驷外科学［M］.6版.北京：人民卫生出版社，1999：1223－1233.

［2］MICHIELSEN P P，FRANCQUE S M，VAN DONGEN J L.Viral hepatitis and hepatocell ular carcino ma［J］.World J Surg Oncol，2005，3：27.

［3］DANBARA N，YURI T，TSUJITA－KYUTOKU M，et al.Enterolactone induces apoptosis and inhibits growth of Colo 201 hu man colon cancer cells bot h in vitro and in vivo［J］.Anticancer Res，2005，25（3B）：2269－2276.

［4］王俊杰，俞莉章，申文江，等.薏苡仁提取物体外对肾癌细胞系放射敏感性的影响及作用机制探讨［J］.癌症，1999，18（6）：680－682.

［5］冯斌，刘继红，陈黎.康莱特注射液对晚期恶性肿瘤的姑息治疗［J］.中国肿瘤临床，1999，26（3）：238－240.

［6］WEBER G F，MENKO A S.The canonical intrinsic mitochondrial death pathway has a non－apoptotic role in signaling lens cell differentiation［J］.J Biol Chem，2005，280（23）：22135－22145.

［7］REED J C，REED S I.Survivin cell－separation anxiety［J］.Nat Cell Biol，1999，1（8）：E199－200.

［8］赵光兵，宋修岐，孙少杰.胃癌组织Survivin和VEGF－C的表达及意义［J］.青岛大学医学院学报，2009，45（10）：465－467.

［9］SHIN S，SUNG B J，CHO Y S，et al.An anti－apoptotic pr otein hu man Survivin is a direct inhibitor of caspase－3 and caspase－7［J］.Biochemistr y，2001，40（4）：1117－11123.

［10］O’CONNOR D S，GROSSMAN D，PLESCIA J，et al.Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of surviving［J］.Pr oc Natl Acad Sci USA，2000，97（24）：13103－13107.

［11］SUZUKI A，ITO T，KA WANO H，et al.Survivin initiates procapase 3／p21 co mplex for mation as a result of interaction with CDK4 to resist Fas－mediated cell deat h［J］.Oncogene，2000，19（10）：1346－1353.

［12］GIODINI A，KALLIO M J，WALL N R，et al.Regulation of microtubule stabilityand mitotic progression by survivin［J］.Cancer Res，2002，62（9）：2462－2467.