李国辉，钟其顶，高红波，熊正河，肖冬光

1(天津科技大学生物工程学院，天津，300457)2(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

黄酒营养最丰富，富含各类氨基酸，其氨基酸主要来自原料及微生物的代谢作用，氨基酸种类及含量高低是评价黄酒风味和营养质量的一项重要指标［1］。

氨基酸的检测方法有显色法［2］、氨基酸自动分析仪法［3］、高效液相色谱法［4］和毛细管电泳法［5］。目前，采用气相色谱分离检测氨基酸的方法在国际上已有报道［6－8，10－12］，在稳定同位素标记的黄酒氨基酸代谢流分析中，由于同位素质谱仪与液相色谱联机局限性，基于液相分离的黄酒氨基酸无法注入稳定同位素质谱仪测定。因此，开发一种基于气相色谱分离检测氨基酸的方法具有重要现实意义。

采用气相色谱分离的氨基酸检测方法需将氨基酸转化为非极性易挥发的衍生物，衍生方法主要包括:硅烷化、酯化和酰化等。其中硅烷化反应具有一步加热反应完成，反应条件相对温和、快速，操作简便，衍生样品可直接进行仪器分析等优点。目前用于甲基硅烷化反应的衍生试剂主要有N，O-双三甲硅烷基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)、N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)及N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氯乙酰胺(MTBSTFA)反应形成叔丁基二甲基氯硅烷(TBS)衍生物［13］。而MTBSTFA在分析化合物特征离子及稳定性方面更优于BSTFA［14］。衍生原理如下:在氨基酸的氨基和羧基端分别连接-TBDMS基团，经高温裂解之后，部分化学键将沿图1所示的虚线处断裂，测定氨基酸特定基团R［15］。

图1 MTBSTFA衍生氨基酸产物及其断裂位点

本研究建立了一种以MTBSTFA为衍生试剂检测黄酒中主要游离氨基酸的GC-FID方法，为建立气相-燃烧-同位素比率质谱(GC-C-IRMS)测定黄酒中氨基酸13C稳定同位素丰度检测方法和黄酒氨基酸稳定同位素代谢流分析奠定了基础。

1 材料方法

1.1 仪器

气相色谱仪(Agilent 6890，Agilent Technologies公司)，氢离子火焰检测器，高效液相色谱仪(waters 2695，Waters公司)，恒温水浴锅(Thermo star-95)，氮吹仪(MTN-2800D)，分析天平(Mettler Toledo AB204-N)等。

1.2 试剂

氨基酸标准品(Waters公司)，衍生试剂N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(≥95%，购自Sigma–Aldrich公司)，辅助衍生试剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈(ACN)为国产色谱纯。

1.3 氨基酸标准工作液

分别准确称取各氨基酸标样0.100 0 g，用0.1 mol/L HCl定容至100 mL，4℃保存，作为标准储备液。使用时稀释，分别设置50～500mg/L不同的浓度梯度。

1.4 衍生条件

取一定浓度的氨基酸标准液50 μL置于2 mL进样瓶中，氮吹仪下40℃吹干。加入100 μL辅助衍生试剂DMF和100 μL衍生试剂 MTBSTFA，80℃反应60 min，反应完成后冷却至室温，待测。

1.5 色谱条件

DB-5毛细管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm，Agilent Technologies);载气为氮气;柱流速1 mL/min;进样口温度250℃;升温程序为:起始温度120℃，保持2 min，，保持10 min;进样体积1 μL;分流比 20∶1。

1.6 标准曲线

取50～500 mg/L的氨基酸标准液50 μL，氮吹仪下40℃吹干，加入衍生试剂和辅助衍生试剂，80℃衍生，60 min。冷却至室温后进行GC-FID检测。

1.7 样品测定

取4℃下10 000 r/min离心10 min后的黄酒上清液50 μL，氮吹仪下40℃吹干。按上述1.4条件衍生，衍生后0.22 μm微孔滤膜过滤，冷却至室温待测。

1.8 回收率及精密度

取4℃下10 000 r/min离心10 min后的黄酒上清液50 μL，加入不同浓度的各氨基酸标准液，按1.7方法处理。分别衍生处理5次，计算RSD值。

1.9 HPLC法测定黄酒中氨基酸含量

方法见文献［16］。

2 结果与分析

2.1 氨基酸衍生条件优化

衍生反应的效率与反应条件密切相关，部分文献报道氨基酸标准液使用纯水配制较使用0.1 mol/L HCl配制时谷氨酸和丝氨酸的衍生效果会稍有提高［17］。但是由于黄酒自身的微酸性性质，本实验不讨论纯水与0.1 mol/L HCl对衍生效率的影响。主要从反应温度、时间和试剂对衍生效果进行比较优化。

分别选取谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)和赖氨酸(Lys)作为参考氨基酸。其中各氨基酸的峰面积加和表示衍生效率。分析结果显示在不同衍生条件下DMF的辅助衍生效果均优于ACN(图2)。

图2 不同时间和温度下ACN和DMF辅助衍生效率比较

由图3可知，使用DMF辅助衍生试剂在80℃反应60min时，衍生效果最好。综合各项条件，选用DMF为辅助衍生试剂，在80℃、60 min条件下进行衍生，且各氨基酸衍生峰分离度良好(图4)。

图3 不同衍生条件下DMF辅助衍生效率比较

图4 氨基酸经MTBSTFA衍生GC-FID分析图谱

2.2 准确性和回收率

采用上述衍生条件，分别以各种氨基酸峰面积y对各氨基酸含量x(mg/L)作线性回归。各回归方程的相关系数R2除脯氨酸、苏氨酸和天冬氨酸为0.98外，其余氨基酸均大于0.99，相关性良好;LOD(3S/N)为0.61～7.13 mg/L(见表1)。

取同一黄酒样品衍生后，连续测定5次，RSD在0.4% ～2.9%之间，方法重复性良好。

样品加标回收实验结果表明，除精氨酸外，黄酒中氨基酸加标回收率在87.11%～119.47%之间;RSD为0.5% ～4.6%(n=5)，满足黄酒中微量氨基酸含量准确测定要求。由图4A和4B可见，在一定浓度下精氨酸与衍生试剂结合后所获得FID信号较弱。分析其原因，精氨酸与主链最接近的旁链部分较长、而另一端的旁链则是一个胍基。胍基的酸度系数(PKa值)为12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都带正电荷。在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得胍基能形成多重的氢键。进而在与衍生试剂结合之后R基团不易断裂。

表1 17种氨基酸的线性方程及相关系数

表2 样品加标回收率

同一黄酒样品分别通过GC-FID和HPLC-UV检测分析，测定结果基本一致(见表3)。经SPSS双变量相关分析，皮尔逊相关系数R为0.998(见表4)，表明本方法与成熟的HPLC方法具有可比性，且准确性较高。

表3 不同方法对黄酒中氨基酸检测结果比较

表4 GC-FID与HPLC测定结果相关性分析

2.3 GC-C-IRMS初步测定

利用GC-FID的衍生和测定条件，使用 GC-CIRMS对氨基酸衍生样品进行初步测定，如图5所示。17种氨基酸均出峰，且分离度良好，可有效测定各氨基酸稳定碳同位素比值(δ13C)。

图5 氨基酸衍生物中δ13C经GC-C-IRMS分析谱图

3 结论

本研究建立以MTBSTFA为衍生试剂，测定黄酒中17种游离氨基酸的GC-FID方法。该方法操作简便、准确、重现性好，适合黄酒中游离氨基酸的定量分析;基于气相分离原理，为今后开发GC-C-IRMS测定黄酒中氨基酸同位素方法奠定了良好基础。

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