响应面法优化连翘叶中连翘苷提取工艺研究

2012-11-19韩晓彤

作物研究 2012年5期

王杰，韩晓彤，张薇，李霞

(湖南农业大学理学院，长沙410128)

连翘(Forsythia suspensa)是木犀科植物连翘属落叶灌木，性寒、味苦，常以果实入药，是中药中最常见的药材之一，具有清热解毒、消结散肿、抗菌及抑制真菌等功能，常见的中成药如双黄连口服液、银翘片等制剂均是以连翘果实作为主药[1]。连翘苷和连翘酯苷是中药连翘的主要生物活性组分，也是国家药典所规定的连翘质量控制指标性成分[2](连翘苷含量不少于0.15%)。研究表明，连翘苷和连翘酯苷均具有较好的抗菌和抗病毒作用[3]。

研究显示，连翘资源在我国非常丰富，且连翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，如:连翘叶中连翘苷含量远高于连翘果实，含量差别超过40倍[4]。对连翘叶及连翘果实的化学成分分析显示:连翘苷、连翘脂素、齐墩果酸等生物活性成分在叶中含量均高于果实[4]，因此连翘叶具有十分广泛的药用价值。目前人们对于连翘的药用价值主要集中在连翘果上，尚未见关于连翘叶的利用开发，因此对于其研究不仅有利于扩大药源，而且有利于连翘资源的综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料:连翘叶原料购于山西省运城市百叶农特产有限公司。

试剂:连翘苷标准品(中国食品药品检定研究院);乙醇、甲醇均为分析纯。

仪器:UV－2450型紫外分光光度计(日本岛津)、DK－S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 连翘叶中连翘苷的提取方法

称取2.0 g干燥的连翘叶粉于50 mL圆底烧瓶中，分别用浓度为 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液浸泡半小时后在温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下浸提 1、3、5、7、9、11 min，过滤收集滤液。

1.2.2 连翘苷的检测方法

以连翘苷为标准品绘制标准曲线，采用紫外分光光度法测定。测定标准曲线方程为:A=0.04754C+0.00386(R2=0.99705，n=5)。式中:A为波长223 nm处的吸光度;C为连翘苷的含量(mg/L)。

1.2.3 单因素试验

准确移取一定体积按1.2.1法提取的滤液，定容后紫外分光光度法检测连翘苷含量。研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间及提取次数5个因素对连翘苷吸光度的影响，确定各因素的最佳范围，每个因素重复试验3次，取平均值。

1.2.4 响应面试验

基于单因素试验结果，以Design－Expert软件(版本:8.0.5b，生产商:Stat－Ease，Inc.)采用四因素三水平的 Box－Behnken Design(BBD)试验设计[5]，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)的值为自变量，以连翘苷的得率为因变量，研究响应值以及最佳变量的组合[6]。试验因素水平及编码见表1。整个试验设计在中心点共有27次试验、3个重复，试验分两天随机完成。

表1 响应面试验因素水平及编码

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对连翘苷得率的影响

在一定温度、料液比下提取连翘叶一定时间，考察乙醇浓度对连翘苷得率的影响。由图1可知，随着乙醇浓度的增加，连翘苷得率随之增加。当乙醇浓度到达70%以后，连翘苷得率随着浓度增加变化不明显，因此单次提取实验中乙醇浓度选择为70%。

图1 乙醇浓度对连翘苷得率的影响

2.1.2 料液比对连翘苷得率的影响

在一定温度、乙醇浓度下提取连翘叶一定时间，考察料液比对连翘苷得率的影响。由图2可知，随着料液比的增加，连翘苷得率随之增加。当乙醇浓度到达1∶12时，连翘苷得率上升趋势逐渐变缓，结合考虑实际生产的综合成本及生产效率，单次提取实验中料液比选1∶12。

图2 料液比对连翘苷得率的影响

2.1.3 提取温度对连翘苷得率的影响

在一定乙醇浓度、料液比下提取连翘叶一定时间，考察温度对连翘苷得率的影响。由图3可知，随着温度的增加，连翘苷得率随之增加。当温度到达80℃后，随着温度的增加连翘苷得率变化不明显，所以单次提取实验中温度选80℃。

图3 提取温度对连翘苷得率的影响

2.1.4 提取时间对连翘苷得率的影响

在一定温度、乙醇浓度、料液比下提取连翘叶，考察浸提时间对连翘苷得率的影响。由图4可知，随着提取时间的增加，连翘苷得率随之增加。当提取时间达到2 h后，随着提取时间的增加连翘苷得率呈现出下降趋势，这可能是由于时间过长导致连翘苷不稳定，所以单次提取实验中时间选2 h。

图4 提取时间对连翘苷得率的影响

2.1.5 提取次数对连翘苷得率的影响

在一定温度、乙醇浓度和一定料液比下提取连翘叶一定时间，考察提取次数对连翘苷得率的影响。由表2可知，连续提取4次以后，Abs的值接近于0，因此不再进行第5次提取。用上述方式提取2次时，连翘苷的累积得率达到94.26%，此时随着提取次数的增加，连翘苷得率受到的影响不大，综合考虑得率及生产成本，提取次数为2次。

表2 不同提取次数的连翘叶中连翘苷得率

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面分析方案及试验结果

在单因素试验的基础上，以Design－Expert软件，依据BBD的中心组合实验设计原理，确定了四因素三水平的响应面分析法，提取次数均为两次。连翘苷的提取结果见表3。

表3 响应面设计和连翘苷得率

2.2.2 多元二次响应面回归模型的建立与分析

对上述回归模型进行方差分析，回归模型的失拟项为0.8347，没有显著性差异;p值小于0.0001，表明模型处理间差异极显著。其R2值为0.9635，表明此模型能解释96.35%响应值变化，这表明该模型具有良好的相关性。回归模型各项的方差分析还表明，各因素料液比的一次项是显著的，交互项AC、AD、BC、BD，二次项 C2、D2都表现为极高的显著性，说明该模型的拟合度好。

利用Design Expert软件，对试验设计各组合处理得到的连翘苷得率进行二次回归分析，建立多元响应面回归模型 y=－0.701－2.400E－003A－0.0406B+0.0339C+0.0240D+1.300E－004AB+7.100E－005AC+6.050E－004AD+3.650E－004BC+3.525E－003BD+1.300E－004CD－4.189E－005A2－5.033E－005B2－2.713E－004C2－0.0294D2。

由回归方程经处理得到的乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间之间的交互作用对连翘苷得率影响的响应面及其等高线如图6所示。其中料液比和提取温度的交互作用对连翘苷得率的影响最为显著，表现为响应面落差较大，乙醇浓度和提取温度的交互作用次之。其余因素之间的交互作用也表现出较显著的效果。通过对图5的分析可以看出，在此4个因素中，料液比对连翘苷得率的影响最为显著，其余依次为乙醇浓度、提取时间和提取温度。此外，各交互因素的最佳作用点基本都落在了试验范围之内，证明此响应面试验设计较为合理。

图5 乙醇浓度、料液比、温度、时间交互作用对连翘苷得率影响响应面

2.2.3 模型的验证试验

通过连翘苷得率的二次多项数学模型解逆矩阵，得出从连翘叶中提取连翘苷的最佳工艺条件参数为:乙醇浓度80%，料液比1∶14，提取温度83℃，提取时间2 h，在此条件下，连翘苷最高得率预测值0.3960%。为验证RSA法的可靠性，采用上述最优提取条件进行连翘苷提取试验，重复3次得到连翘苷得率的平均值为0.3895%，与理论预测值相差不大，因此，采用RSA法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。