霍爱晶，马健飞，李程程，邓文艳，王力宁

（中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳 1 1 0 0 0 1）

腹膜纤维化已成为多数慢性肾衰患者退出腹膜透析的一个主要因素。腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）在腹膜纤维化中起关键作用。当暴露在透析相关性腹膜炎环境下时，PMC的形态、结构及功能发生变化，导致其最终进入不可逆性腹膜纤维化阶段。本研究通过观察高糖透析液及炎性因子脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）单独及联合作用下骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及纤维化因子转化生长因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）表达的变化，进一步揭示腹膜纤维化的发生及阻断机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠，体质量160~200 g，普通级，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂：DMEM/F12干粉培养基、胎牛血清（天津灏阳）；LPS粉剂（美国Sigma公司）；0.25%胰酶（沈阳博尔美公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；OPN多克隆抗体、DAB显色液、SABC试剂盒（武汉博士德公司）；Real-time RT-PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）；PCR引物由北京华大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PMC（RPMC）的培养、传代与鉴定：具体方法参照文献［1］。

1.2.2 免疫组织化学法检测OPN的表达：采用24孔板培养细胞无菌爬片24 h后，无血清同步化12 h，分组并作用 24 h：（1）正常对照组：培养基中葡萄糖浓度 0.1%；（2）2.5%高糖组；（3）LPS（50 μmol/L）组；（4）2.5%高糖+LPS（50 μmol/L）联合作用组。4%多聚甲醛固定，0.5%Trix X-100打孔，3%H2O2甲醇室温孵育，灭活内源性过氧化物酶，血清封闭孵育，分别滴加1︰150稀释的OPN一抗试剂，4℃过夜（PBS代替一抗做阴性对照），滴加羊抗兔IgG孵育，DAB显色。OPN以胞质及胞核染色为阳性，选取不同视野（×100）计算单位面积阳性染色区域平均积分光密度（A）。计数OPN染色阳性细胞数占1个视野总细胞数的百分比。……