欧阳金旭 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

熊 涛 (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

杨玉莹 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

猪鹦鹉热衣原体的分离与鉴定

欧阳金旭 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

熊 涛 (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

杨玉莹 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

以新鲜猪粪便为材料，采用鸡胚分离培养法从荆州地区的猪群中分离出 4株鹦鹉热衣原体 ，通过光学显微镜检查、药敏试验、碘染试验和动物致病性试验对 4株衣原体进行了鉴定 。结果表明 ，所分离的4株衣原体均为鹦鹉热衣原体。

猪群；鹦鹉热衣原体；鸡胚；分离培养；鉴定

衣原体是衣原体科衣原体属的严格的细胞内寄生微生物。最新研究认为，衣原体属有4个种，即沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、 鹦 鹉 热 衣 原 体 (C.psittaci)、肺炎衣原体 (C.pnewnonioe)和反刍动物衣原体 (C.pecorum)。动物衣原体病主要是由鹦鹉热衣原体及反刍动物衣原体引起的一种多症候传染病。鹦鹉热衣原体可感染禽类引起禽衣原体病，名鹦鹉热或鸟疫，也感染其他脊椎动物如牛、猪、山羊、绵羊等。反刍动物衣原体目前只从哺乳动物分离到，如牛、绵羊、山羊、树袋熊(Koala)、猪[1]。卢国栋等[2]报道猪衣原体对四环素类抗生素、红霉素、夹竹桃霉素、泰乐菌素、强力霉素、氯霉素及螺旋霉素敏感，对庆大霉素、新霉素、链霉素及磺胺嘧啶钠不敏感。衣原体含有DNA和RNA，以二分裂方式增殖，在细胞胞质内可形成包涵体，易被碱性染料着染。用Giemsa、Gimenez、Ziehl/Neelsen、Macchiavello、Castameda等染色法着色良好。能在鸡胚和McCoy细胞、鼠L细胞、Hela细胞、Vero细胞、BHK21细胞、BGM细胞、Chang氏人肝细胞内生长繁殖，繁殖过程中会产生2种大小不同的颗粒，较小的为原生小体(Elementary body，EB)，直径0.2～0.5μm，呈球形或卵圆形，有传染性[3]。

20世纪90年代初期以来，随着我国集约化养殖业的不断发展，动物衣原体的感染呈现上升趋势。目前最有效的防治动物衣原体感染的措施就是接种安全、有效的疫苗。但由于生物学特性和免疫学机制的复杂性，衣原体感染后寄生于宿主细胞内反而受到宿主细胞的保护，目前研制的多种减毒活疫苗、灭活苗是否能很好地诱导特异性免疫力的产生而不引起其他副作用，以及其有效性和稳定性等都尚待进一步证实。因此，对衣原体进行分离鉴定十分重要。动物衣原体病是一种人畜共患病，禽衣原体病与哺乳动物衣原体病比较，前者对人类健康的危害性更严重[4-5]。做好动物衣原体病的防治工作，在一定程度上能保障人民的财产和人生安全，具有巨大的经济效益和社会效益，对国家“三农”政策的实施具有重大的实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SPF鸡胚由山东无特定病原鸡实验种鸡场提供；新鲜的猪粪便由湖北荆州某猪场采集；衣原体标准株及小牛血清由长江大学动物病原与分子生物学实验室提供。

1.2 病料的处理

采取猪新鲜粪便，加入5倍稀释液(0.01mol/L，pH7.4 PBS溶液)混合，再加入庆大霉素100μg/ml，硫酸链霉素1mg/ml，两性霉素10μg/ml，37℃水浴感作1h。于4℃下，500g离心10min，取上清液按1∶10与细胞营养液(即小牛血清)混合，加链霉素500μg/ml。4℃下，1500g离心20min。取上清液按1∶5与细胞营养液(同上)混合，4℃下，2000g离心20min，取上清液4℃保存待用。

1.3 衣原体分离培养

(1)鸡胚接种 取上述处理后病料以卵黄囊腔接种6～8日龄健康鸡胚，每个鸡胚接种0.12ml。逐日观察鸡胚死亡情况，弃去2日内死亡鸡胚，如果超过6日内鸡胚没有死亡，则收获鸡胚卵黄囊膜，处理后盲传3代。

(2)收获鸡胚 收集4～6日龄死亡鸡胚，无菌操作收取鸡胚卵黄囊膜，置于无菌瓶中，另取少量卵黄囊涂片待镜检。

(3)染色镜检 涂片后自然干燥，然后经甲醇固定5min，干燥后用姬姆萨氏染色液染色30～60min。以pH7.2磷酸缓冲液或中性蒸馏水冲洗，待干后在光学显微镜下观察染色情况。

1.4 衣原体的鉴定

(1)药敏试验 参照文献[6]的方法进行。选取硫酸链霉素、磺胺嘧碇钠、青霉素、氯霉素4种抗生素为药敏材料，分别配制硫酸链霉素(1000μg/ml)、磺胺嘧碇钠(1mg/ml)、青霉素(1000U/ml)、氯霉素(1mg/ml)的PBS液，再分别加入含衣原体的鸡胚材料，4℃作用4h，接种鸡胚，每株接5个胚，弃去污染鸡胚，其余为试验用鸡胚。收集4～6d的死胚涂片检查,记录有红染衣原体颗粒的鸡胚与试验用鸡胚的数量。另每株衣原体各设一组空白对照，即各株衣原体的组织悬液在4℃放置4h后直接接种鸡胚，而不与任何药物作用，观察鸡胚死亡情况。

(2)碘染试验 参照文献[7]方法进行。用分离各衣原体株的鸡胚卵黄囊膜涂片、火焰固定，以Lugol氏碘液染色10min，观察包涵体与背景的颜色。

(3)小鸡接种试验 参照文献[8]的方法进行。选取8～12g健康小鸡18只，分成6组，每组3只，1～5组分别接分离的4株衣原体和标准的鹦鹉热衣原体的卵黄囊悬液；第6组接健康鸡胚的卵黄囊悬液。各组腹腔内接种病料悬液1ml/只，观察鸡的发病情况。接种后1周内无异常者，各组剖杀1～2只，取脾、肝制成悬液用鸡胚分离。

2 结果与分析

2.1 衣原体的分离培养

从病料中共分离出4株衣原体，分别编号为y-1、y-2、y-3、y-4。病料在6～8日龄鸡胚上连续继代3～6代后，可使鸡胚于接种后4～7d出现规律性死亡，并表现出典型的病变特征：胚体充血，出血，鸡胚的头、颈、背部有出血斑；卵黄膜变薄，尿囊液清澈，囊膜水肿。

2.2 染色镜检观察

取少许鸡胚卵黄囊制成涂片，自然干燥，甲醇固定，磷酸缓冲液冲洗后，在油镜下观察发现，有一较大颗粒被染成蓝紫色，较小颗粒被染成紫红色(图1)。这与标准株(图2)染色结果对比相一致。由此可初步表明：分离出来的病株可能是衣原体。

图1 衣原体分离株染色镜检图

图2 衣原体标准株染色镜检图

2.3 衣原体的鉴定

表1 各种药物与衣原体各株悬液作用后接种鸡胚情况

2.3.1 药敏试验

各种药物与衣原体悬液作用后接种鸡胚，结果表明，分离衣原体对磺胺嘧啶钠和链霉素不敏感，而对青霉素和氯霉素敏感(表1)。

2.3.2 碘染实验

将各衣原体株感染的鸡胚卵黄囊涂片碘染后，包涵体与背景一样呈淡褐色，结果均为阴性，说明这5株衣原体不含糖原。

2.3.3 小鸡接种试验

出于对试验条件和试验成本的考虑，试验用小鸡代替小白鼠作材料，进行动物致病性实验。衣原体各株病料悬液接种小鸡后，多数无明显症状，但试验组小鸡出现厌食、精神萎靡、被毛粗乱等现象，而对照组无异常。6～7d后各试验组小鸡的症状均有好转。剖杀后从肝、脾等悬液中分离出了衣原体。由此表明，分离的各衣原体菌株对小鸡有不同程度的致病性。

3 结论与讨论

本研究以发病或没有发病猪的粪便作衣原体分离，分离的4株衣原体株经过鉴定，其形态结构符合鹦鹉热衣原体特征，用姬姆萨氏法染色后，在光学显微镜下可见在淡绿色背景下红染的针尖大小的衣原体小颗粒。在动物试验中，4株衣原体都不能致死小鸡，但小鸡不同程度地表现出了发病症状，并从小鸡都再次分离到了病原。药敏试验结果表明，对青霉素、氯霉素敏感，而对磺胺、链霉素等不敏感。碘染试验为阴性。通过以上各种鉴定，证明所分离到的4株衣原体为鹦鹉热衣原体。

进入21世纪，人畜共患疾病成为公共卫生关注的热点。动物衣原体病是由鹦鹉热衣原体引起的十分重要的自然疫源性疾病。该病人畜共患，呈地方性流行，常造成很大危害及经济损失。已发现侵染18个目、29个科的190余种鸟类(包括家禽)以及绵羊、山羊、奶牛、牦牛、马属动物、猪、狗、猫、猴、兔、豚鼠及小鼠等许多哺乳动物、野生动物和人类，对人类健康是个潜在的威胁，是影响人类公共卫生的重要疫病之一[9]。目前对该病的诊断方法较多。实验室诊断可先采用光学显微镜检查，其次是采用免疫学诊断，包括应用补体结合(CF)试验、间接血凝(IHA)试验，免疫荧光试验、琼脂免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、血凝抑制试验(HI)，变态反应以及衣原体DNA的纯化及检测技术等(Grimes J E，Daft B E，Grumbles L C，et al．A manual of methods for laboratory diagnosis of avian chlamydiosis ．Am Assoc Avian Pathol, Kennet t Square，PA，1987．)。

因衣原体病是一种涉及多种家禽、家畜动物、野生动物和人类的自然疫源性疾病，所以在制定防治措施时，要考虑患病畜禽对人感染的威胁，因此在动物饲养场应采取以下措施：(1)动物饲养生产区与职工生活区要严格分开，场内入口处应设有消毒，更衣设备，严禁非工作人员进场。(2)定期对畜禽进行血清学检查，对种公畜定期进行精液检查。衣原体CF抗体滴度在1∶8以上或在精液中发现衣原体者必须淘汰。少数良种公畜采取隔离用四环素族抗生素治疗1～2个疗程后，再进行两次血清学检查为阴性，精液无衣原体者可留用。(3)如果场内经常发生流产、死胎、肺炎、多关节炎、结膜炎等疾病更应注意，要采取隔离和进一步诊断发病原因，并进行治疗。(4)在调运种畜禽时，在饲料中应添加土霉素或氯霉素、红霉素及多种维生素，减少疫病发生的机会。

[1]朱其太．衣原体分类新进展[J]．中国兽医杂志，2001，(4)：30-31．

[2]卢国栋，郭万正．猪衣原体病及其防治[J]．湖北畜牧兽医，2002，(2)：26-27．

[3]孔繁德，陈信忠，龚艳清,等．从进境大火烈鸟中检出衣原体病[J]．中国动物检疫，2001，(11)：39-40．

[4]Calnek B W(高 福，刘文军，译)．禽病学[M]．北京：北京农业大学出版社，1991．

[5]邱昌庆．禽衣原体病研究进展[J]．畜牧兽医科技信息，2002，(8)：12-14．

[6]杨宜生，姜天童．猪衣原体病研究初报[J]．湖北畜牧兽医，1982，(2)：2-4．

[7]段跃进．猪衣原体病[J]．中国畜禽传染病，1991，(1)：62-63．

[8]杨宜生，姜天童．猪衣原体病的病原分离和鉴定[J]．中国兽医杂志，1984，(9)：4-6．

[9]刘振江，罗启慧．动物衣原体病研究现状[J]．动物医学进展，2004，(2)：29-31.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.03.007

Q93-331

A

1673-1409(2012)03-S024-03

2012-03-07

欧阳金旭(1965-)，男，湖北监利人，硕士生，研究员，主要从事兽医疫病防控研究。