周莉莉，杨士斌，刘志强, 张 卉，胡 梅，祝建华

(1.中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心，吉林 长春 130022；2.山东省产品质量监督检验研究院，山东 济南 250100；3.中国航天科工集团731医院，北京 100074)

2011-09-21；

2011-12-14

国家自然科学基金(20173057)和中国科学院知识创新工程重要方向项目(KGCX2-SW-213-06)资助

周莉莉(1981～)，女(汉)，江苏盐城人，博士，从事天然产物化学与有机质谱学研究。E-mail:zll811128@126.com

刘志强(1962～),男 (汉)，吉林长春人，研究员,从事天然药物化学与有机质谱学研究。E-mail:liuzq@ciac.jl.cn

山茱萸与熟地配伍时山茱萸中主要组分变化规律研究

周莉莉1,2，杨士斌3，刘志强1, 张 卉2，胡 梅2，祝建华2

(1.中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心，吉林 长春 130022；2.山东省产品质量监督检验研究院，山东 济南 250100；3.中国航天科工集团731医院，北京 100074)

为了研究山茱萸与熟地两种药物不同比例配伍时山茱萸中主要组分的变化规律，利用高效液相色谱(HPLC)法和电喷雾质谱(ESI-MS)法比较山茱萸和熟地药材单煎液、合煎液和单煎合并液中山茱萸主要组分的含量变化和各溶液的谱学行为。在一定质量比例内(m(山茱萸)∶m(熟地)≤4∶8)，山茱萸与熟地共煎有相互协同溶出的效应。合煎液中山茱萸莫诺苷、马钱苷和没食子酸组分的百分含量随熟地配伍比例的增加均呈现线性变化规律。不同的配伍方式(合煎与单煎合并)会产生不同的新物质。结果表明，熟地组分的存在对山茱萸组分的溶出有较大影响，但该影响不受温度的限制。

山茱萸；熟地；配伍；高效液相色谱；电喷雾质谱

中药山茱萸为山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSeib et Zucc．除去种子的干燥成熟果肉，最早见于《神农本草经》，具有补益肝肾、涩精固脱等功效[1]。莫诺苷、马钱苷等环烯醚萜苷类化合物是山茱萸中主要的水溶性组分，生物免疫抑制活性很强[2-4]。没食子酸是山茱萸水溶液中主要的收涩抗炎组分，大量的研究已证实没食子酸具有抗肿瘤、杀锥虫、抗病毒和收缩血管[5]等生物学作用，安全性好[6]。

山茱萸、熟地药对见于《小儿药证直决》地黄丸、《金匮要略》肾气丸、《医学衷中参西录》滋膵饮等方。山茱萸固涩气阴，平补肝肾，性平和；熟地黄善补精血，益肝肾，性滋腻。熟地黄有止血功能，可增山茱萸固崩止血之力；熟地黄得山茱萸平补之助，滋养肝肾之力更强。二药配伍，互补互使，养血补精、止血涩精功力增加。用量山茱萸6～15 g，熟地黄9～30 g，经典配伍质量比例为m(山茱萸)∶m(熟地)=4∶8。赵进喜[7]针对糖尿病、肾病皆有肾虚、精微不固病机,经常选用二药,补肾固肾,对于肾虚精微不固所致的腰膝酸痛、尿频量多、眩晕耳鸣、自汗盗汗、阳萎遗精等症收效显著。但目前还没有对这组药配伍的化学研究报道。

本实验以不同方式、不同比例的山茱萸熟地配伍，通过溶出率、高效液相色谱(HPLC)、电喷雾质谱(ESI-MS)等分析手段研究药材单煎、合煎和单煎合并过程中的溶出行为，从不同角度阐明山茱萸熟地配伍时，山茱萸中主要组分的变化规律和两药材间的明显相互作用。

1 实验部分

1.1仪器和设备

1.2试剂与材料

乙腈、甲醇、醋酸(色谱纯)：美国Fisher公司产品；其余试剂均为分析纯：北京化工厂产品；水为超纯水(18.2 MΩ·cm)；0.45 μm滤膜：美国Agilent公司产品。

山茱萸(CornusofficinalisSeib et Zucc．)，熟地(RadixRehmanniaePreparata)：购自同仁堂，由长春中医药大学王淑敏教授鉴定。莫诺苷、马钱苷、没食子酸标准品：购自中国药品生物制品检定所。

1.3实验方法

1.3.1样品液的制备 单味中药山茱萸与熟地分别用水单煎；山茱萸与熟地按4∶1，4∶2，4∶4，4∶8，4∶12的质量比合煎；单煎液按经典比例合并。1)单煎：称取一定量的山茱萸和熟地，各自称取煎煮前的质量，并分别用纱布包扎，放入烧杯中，加入250 mL蒸馏水热浸30 min,急火烧开后保持微沸并计时，煎煮2次，每次45 min,合并滤液，减压浓缩并定容，得山茱萸与熟地的单煎液。所得药渣于40 ℃下烘干至恒重，并称取煎煮后的质量。2)合煎：将按质量比准确称得的山茱萸和熟地包在同一块纱布中，按单煎的条件同样煎得合煎液。药渣分离后，分别于40 ℃下烘干至恒重，并分别称得煎煮后的质量。3)单煎合并：分别取山茱萸单煎液和熟地单煎液，按生药量浓度相等换算，按山茱萸熟地质量比4∶8配得单煎合并液。

1.3.2质谱条件 质量扫描范围m/z100～1 500，喷雾电压5 kV，壳气为氮气，壳气压6 MPa，金属毛细管温度250 ℃，电压10 V，质谱检测采用负离子模式。

1.3.3色谱条件 色谱柱：Capcell Pak C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；莫诺苷、马钱苷测定：V(乙腈)∶V(水)=15∶85的混合溶液，检测波长240 nm；没食子酸测定：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(0.3%醋酸)=5∶6∶89的混合溶液,检测波长270 nm；流速0.7 mL/min；柱温35 ℃。山茱萸与熟地共煎液样品色谱图示于图1。

目前，常用的浮选方案主要有两种：浮选机分选和浮选柱分选工艺。考虑到公司选煤厂空间狭窄，旋流微泡浮选柱设备占地面积小，无运动部件，磨损小，维护工作量小，维护费用低，操作简单，调整容易，并且精煤灰分调整幅度大，可根据煤质和市场生产灰分不同的精煤等因素，决定采用FCMC-4500型旋流微泡浮选柱工艺。

1.4方法学考察

1.4.1线性关系考察 分别取2、4、6、8、10 μL 3种标准品溶液进样，以标准品含量(x)对相应峰面积积分值(y)进行回归，得回归方程和线性范围。

莫诺苷：y=2.08×106x+1.35×104,r=0.999 7,线性范围0.4～2.02 μg。

图1 山茱萸与熟地共煎液样品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the decoction of Fructus Corni with Radix Rehmanniae Prepatrata

马钱苷:y=4.25×106x+3.36×104,r=0.999 6,线性范围0.52～2.60 μg。

没食子酸:y=5.84×106x+2.36×104,r=0.999 9,线性范围0.112～0.56 μg。

1.4.2精密度实验 取同一份样品液，连续进样5次，3个色谱峰保留时间RSD分别为0.15%、0.14%、0.18%,峰面积RSD分别为0.25%、0.23%、0.28%。

1.4.3稳定性实验 取同一份样品液，每隔4 h进样1次，共测定5次，3个色谱峰保留时间RSD分别为0.52%、0.46%、0.58%,峰面积RSD分别为0.84%、0.94%、1.07%。

1.4.4重现性实验 将山茱萸和熟地单煎液按质量比4∶8合并，得到5份单煎合并液。分别按1.3方法进样分析，3个色谱峰保留时间RSD分别为1.58%、1.25%、1.97%,峰面积RSD分别为1.92%、1.80%、1.61%。

1.4.5加标回收率实验 精密称取5份适量样品，分别加入一定量的莫诺苷、马钱苷和没食子酸标准品，按样品分析方法进行处理，并各平行测定2次。3种成分的平均加标回收率分别为

99.98%、100.57%、100.24%，RSD分别为2.84%、2.36%、2.74%。

2 结果与分析

2.1协同溶出效应

山茱萸和熟地单煎、合煎前后质量变化及溶出率，列于表1，数据均为3次重复实验的平均值，相对标准偏差(n=3)在0.7%～3.0%之间。可以看出：对山茱萸而言，山茱萸单煎时其溶出率为67.61%，山茱萸与熟地配伍时，除过大质量比(4∶12)外，合煎后山茱萸的溶出率都比单煎时增加，但随着熟地比例的增加，山茱萸溶出率呈线性下降，合煎质量比为4∶8时，与单煎的溶出率相近；对熟地而言，合煎比例较小时，合煎后熟地的溶出率比单煎时增加，合煎比例过大时，则反之。分析原因可能是，熟地中含有大量寡糖，合煎比例过高后煎液粘度过大，抑制了溶出程度。溶出实验结果表明，在一定质量比例内(m(山茱萸)∶m(熟地)≤4∶8)，山茱萸与熟地可相互促进组分在水中的溶出，有相互协同溶出的效应，说明山茱萸和熟地间存在相互作用。

表1 山茱萸与熟地溶出率结果

2.2样品含量测定

按1.3方法操作，进样10 μL，测定山茱萸与熟地不同配伍比例各样品中莫诺苷、马钱苷和没食子酸的含量，结果列于表2。从表2可知，熟地中不含有这3种组分，测定结果数据均来源于山茱萸中成分。山茱萸中这3种组分的百分含量和配伍比例之间的关系示于图2。 从表2和图2可以看出：1)合煎液山茱萸中莫诺苷和马钱苷组分的百分含量随熟地配伍比例的增加呈线性增大，但均低于山茱萸单煎液；没食子酸含量变化趋势则相反，合煎液山茱萸中没食子酸组分的百分含量随熟地配伍比例的增加呈线性下降，但均高于山茱萸单煎液；2)按经典配伍比例配制的m(山茱萸)∶m(熟地)=4∶8单煎合并溶液中，莫诺苷、马钱苷的含量低于同样质量比例的合煎液，没食子酸的含量高于同样质量比例的合煎液，这与这3种组分百分含量在不同配伍比例时的变化趋势吻合。这两点均表明，熟地对山茱萸中各有效组分的溶出均有较大影响。采用先对单味药材进行煎煮，然后对单煎液进行配伍的思路，可以消除药材共煎过程中山茱萸组分和熟地组分之间的相互作用。对比结果说明，熟地对山茱萸组分的影响不仅仅在煎煮过程中进行，常温下也可以进行。在实验过程中，未发现合煎液或者单煎合并液出现沉淀。从化学成分角度考虑，组分含量的变化可能是因为熟地中的主要成分为寡糖和环烯醚萜苷类，熟地中某种成分促进了没食子酸的溶出，而熟地中的环烯醚萜苷类成分与山茱萸中环烯醚萜类——莫诺苷和马钱苷存在溶出竞争，引起莫诺苷和马钱苷溶解度下降，或者部分形成新的化合物而减少了莫诺苷和马钱苷的含量检出。

表2 各样品中莫诺苷、马钱苷和没食子酸的质量百分含量Table 2 Percentage of Morroniside, Loganin and Gallic acid in samples

图2 3种组分的配伍比例与百分含量之间的变化趋势Fig.2 Variations of fractional contents of Morroniside、Loganin and Gallic acid at different proportions

2.3电喷雾质谱分析

电喷雾质谱仪采用电喷雾电离(ESI)，属于软电离质谱技术，通常不形成碎片离子，只形成分子离子峰，因此可以认为，采用电喷雾质谱一级全扫描得到的谱图中的各峰反映了样品中的不同组分。山茱萸单煎液样品(a)、熟地单煎液样品(b)、经典配伍比例4∶8的合煎液样品(c)和4∶8单煎合并溶液样品(d)负离子模式下的电喷雾一级全扫描图示于图3。 比较各质谱图中分子离子峰的质荷比和相对峰强度，并对山茱萸中已知的化合物进行归属，结果列于表3。可以看出:1)除了m/z837的峰，其它在山茱萸单煎液中可以检测到的质谱峰，在合煎液和单煎合并液中都可以检测到；而部分在熟地单煎液中可以检测到的质谱峰，未在合煎液或者单煎合并液中出现。2)在合煎液中出现了在单煎液中找不到的m/z623、879和1 418峰，在单煎合并液中找到了在单煎液中未曾出现的m/z1 143和1 305峰。这些结果表明，定性分析山茱萸与熟地配伍时，山茱萸中化学成分受到的影响较小，而熟地化学成分受到了更多的影响，二药的相互作用使得原本在单煎过程中可以很好地溶出组分在合煎和单煎合并过程中不再溶出，煎出液中产生了新的物质，并且在合煎液和单煎合并液中发生了不同的化学反应。

图3 典型样品的电喷雾负离子全扫描质谱图Fig.3 ESI full mass spectra of typical samples in the negative ion mode

表3 典型样品的质谱数据

3 小结

采用先对单味药材进行煎煮，然后对单煎液进行配伍的思路可以消除药材共煎过程中山茱萸组分和熟地组分之间的相互作用。按经典配伍比例配制的山茱萸熟地4∶8单煎合溶液中，莫诺苷、马钱苷的含量低于4∶8合煎液，没食子酸的含量高于同比例合煎液，这与该3种组分百分含量在不同配伍比例时的变化趋势吻合，说明熟地组分对山茱萸组分的影响在常温下也可以进行。

本研究通过山茱萸与熟地单煎、合煎溶出率的比较，发现山茱萸与熟地有协同溶出效应；通过HPLC法检测不同方式、不同比例的配伍溶液中山茱萸有效成分——莫诺苷、马钱苷和没食子酸的含量，发现这3种有效成分的含量随着熟地配伍比例的增加均呈现线性变化规律；通过ESI-MS法观察各配伍溶液的质谱行为，发现山茱萸与熟地之间的作用不仅可以产生单煎液中不存在的新物质，还可以抑制熟地中部分组分的溶出。在二药的共煎与单煎合并过程中，发生了不同的反应，产生了不同的新物质。熟地对山茱萸的作用不受煎煮过程和温度的影响。中药配伍过程中变化的方法为深入研究中药作用机理、加速中药现代化提供了一条新的思路。

[1] 赵友仁.山茱萸的本草考证[J].中药材, 1987, (5): 51-54.

[2] 戴 岳, 杭秉茜, 黄朝林，等.山茱萸对小鼠免疫系统的影响[J].中国药科大学学报, 1990,21(4): 226-228.

[3] 付桂香, 李建民, 周 勇, 等. 山茱萸总苷抗炎免疫抑制作用及其机理的大鼠实验研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2007,27(4): 316-320.

[4] 赵武述，张玉琴，占志农，等。山茱萸总甙的免疫药理研究Ⅱ：总甙部分抑制免疫反应的体外效应[J].中日友好医院学报，1991,5(2): 71-75.

[5] SAKAGAMI H, SATOH K. Prooxidant action of two antioxidants: ascorbic acid and Gallic acid[J]. A nticancer Res, 1997, 17(1A):221-224.

[6] NIHO N, SHIBUTANI M, TAMURA T, et al. Subchronic toxicity study of Gallic acid by oral administration in F344 rats [J]. Food Chem Toxicol, 2001, 39 (11):1 063-1 070.

[7] 杨 敏.中药药对治疗糖尿病肾病临证撷菁[J]. 辽宁中医杂志, 2006,33(4): 462-463.

StudiesonContentsVariationofMainComponentsinFructusCorniafterCombinationwithRadixRehmanniaePreparata

ZHOU Li-li1,2, YANG Shi-bin3, LIU Zhi-qiang1，ZHANG Hui2，HU Mei2，ZHU Jian-hua2

(1．ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China；2.ShandongProvincialInstituteofProductQualitySupervision&Inspection,Ji’nan250100,China; 3.Aerospace731Hospital,Beijing100074,China)

To study the contents variation of main components inFructusCorni(FC) after combination withRadixRehmanniaePrepatrata(RRP). The reciprocity of FC with RRP were investigated by means of high performance liquid chromatography (HPLC) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) technique in the negative ion mode. FC with RRP was decocted separately, and then the separate aqueous extracts were combined partly. Different proportions of FC with RRP were decocted together. The contents of Morroniside, Loganin and Gallic acid in these samples were analyzed, synchronously, mass action of these samples were examined. FC with RRP promoted each other in dissolving percents in certain suitable quality proportion (FC∶RRP ≤ 4∶8). Together-decocted and single-decocted merger can produce different new materials. The existence of RRP has great influence on the dissolution of components in FC which would not restricted by temperature. It provides a certain science basis for the reasonable Chinese herbal medicine.

Fructuscorni;RadixRehmanniaePrepatrata; combination; HPLC; ESI-MS

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0074-07