郑司浩，孙稚颖，黄林芳*

(1.中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

麦冬及其混伪品的ITS2序列分析及鉴别研究

郑司浩1，孙稚颖2，黄林芳1*

(1.中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

目的对麦冬及其易混伪品进行分子鉴别，以确保该药材的质量和临床安全用药。方法从GenBank数据库中下载麦冬及其混伪品的ITS2片段序列，利用MEGA等软件进行相关数据分析，构建NJ树，并预测麦冬及其混伪品的ITS2二级结构。结果麦冬与其3个混伪品的ITS2序列间存在明显差异，基于ITS2序列的NJ树及其二级结构亦能对麦冬及其混伪品进行鉴别。结论ITS2条形码序列可有效地鉴别麦冬及其混伪品。

麦冬；混伪品；ITS2；分子鉴定；DNA条形码

药材麦冬(Ophiopogonis Radix),又名沿阶草、书带草、麦门冬，为百合科植物麦冬(Ophiopogon japonicus (L.f) Ker-Gawl.)的干燥块根[1]。麦冬性甘、微苦，微寒，有养阴生津，润肺清心之功效，用于肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴，心烦失眠，肠燥便秘等症。药理作用研究表明，麦冬在降血糖、抗衰老、抗氧化及改善心脑血管疾病方面作用明显[2]。由于各地用药习惯不同，市场上出现许多麦冬的混伪品，主要有阔叶山麦冬(Liriopemuscari〔Decaisne〕 L.H.Bailey)、山麦冬(Liriopespicata〔Thunberg〕 Loureiro)、石刁柏(AsparagusofficinalisL.)等[3-4]。利用分子生物学技术进行药用植物的鉴定和区别近年来成为国内外研究热点，其中DNA条形码鉴定技术倍受学术界关注[5-7]。DNA条形码技术是一种新的生物鉴定方法，它应用短的、标准的DNA片段作为物种标记。在众多条形码中，ITS2片段具有更多优点，它在物种水平变异较快、序列片段较短，是最具有潜力的候选DNA条形码之一[8-12]。本文以ITS2条形码序列鉴定麦冬及其3种混伪品阔叶山麦冬、山麦冬和石刁柏，以期建立一种快速、有效、准确的分子鉴定方法，确保其药材的质量及用药安全。

1 材料与方法

1.1 材料来源

所用ITS2序列从GenBank下载，详情见表1。

表1 材料来源

1.2 数据分析

运用MEGA等软件分析研究样本的ITS2序列，计算种内种间遗传距离(K-2P距离)等，并建立NJ树进行物种鉴定。利用Schultz等[13]建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。

2 结果与分析

2.1 麦冬种内序列变异及分析

麦冬8条种内参考序列比对后长度为219 bp，种内序列变异位点有6处，如图1所示。麦冬种内ITS2序列的平均K-2P距离为0.009 0，最大K-2P距离为0.018 5。

2.2 麦冬种间序列变异及分析

麦冬与其混伪品的序列种间变异位点较多，见图2。麦冬及其混伪品ITS2序列种间K-2P距离的平均值为0.183 3，最小K-2P距离为0.084 6。

2.3 麦冬及其混伪品ITS2序列NJ树构建及分析

利用系统聚类的方法，基于ITS2序列构建NJ树(见图3)。从树图可以看出，正品麦冬与麦冬属其他混伪品阔叶山麦冬、山麦冬以及天门冬属的石刁柏可以有效鉴别开。

图3 基于ITS2序列构建的麦冬与其混伪品的邻接(NJ)树

2.4 麦冬及其混伪品ITS2序列二级结构及分析

利用Schultz等[11]建立的ITS2数据库及其网站预测了麦冬及其混伪品的ITS2二级结构，如图4所示，通过比较麦冬与其混伪品ITS2序列二级结构可以看出，麦冬与阔叶山麦冬的ITS2序列二级结构在螺旋II和IV区保守，在螺旋I和III区有差异；麦冬与山麦冬在螺旋II区保守，在螺旋I、III和IV区均有差异；麦冬与伪品石刁柏在四个螺旋区均有明显差异。因此，基于ITS2序列预测的二级结构的比较也可以有效的鉴别麦冬及其混伪品。

图4 麦冬与其混伪品ITS2二级结构比较

3 讨论

麦冬为我国常用中药材，应用广泛，具有重要的药用价值。然而其地方习用品和混伪品市场上较多，导致该药材在流通和使用中出现混乱。传统鉴别麦冬的方法有性状鉴别、显微鉴别、理化鉴定及薄层色谱等[14-18]，但是存在一定的局限性，主要表现在单一的传统鉴定方法不能准确的鉴别麦冬及其混伪品，需多种方法综合分析，只能为鉴定提供参考依据。DNA条形码技术具有技术成熟、操作简便、迅速、可靠、适合广泛推广等优点，是一种新的分子生物鉴定技术。

本文应用DNA条形码技术测定了麦冬及其混伪品的ITS2序列并预测了它们的ITS2二级结构，研究结果表明，麦冬及其混伪品的ITS2序列变异明显，种内最大遗传距离(K-2P距离,0.018 5)小于种间最小遗传距离(0.084 6)；基于ITS2序列建立的NJ树可以很明显的把不同来源的麦冬及其混伪品鉴别开来；此外，通过ITS2序列预测的二级结构同样可以从直观上更好的鉴别麦冬及其混伪品。总之，基于ITS2序列的DNA条形码技术可以简便、准确地鉴定麦冬及其混伪品，对保障该药材使用的安全性和有效性具有重要的意义。

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AnalysisandIdentificationofOphiopogonjaponicusandItsAdulterantsUsingITS2Sequences

ZHENG Si-hao1,SUN Zhi-ying2,HUANG Lin-fang1

(1.TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine,MinistryofEducationInstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193China;2.CollegeofChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective: To analysis the DNA barcodes ofOphiopogonisRadixand its adulterants,and to ensure the quality and clinical safety of drugs.MethodsDownload the ITS2 sequences ofOphiopogonisRadixand its adulterants from GenBank database,and the genetic distances were computed using MEGA 4.0 in accordance with the Kimura 2-Parameter (K2P) model,and the phylogenetic tree was constructed.The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website founded by Schultz et al.ResultsOphiopogonisRadixand its adulterants can be identified by the differences of the ITS2 sequences.The phylogenetic tree and the ITS2 secondary structure can also distinguish betweenOphiopogonisRadixand its adulterants.ConclusionITS2 barcode sequences can serve as a valuable marker to identifyingOphiopogonisRadixand its adulterants,and it has a broad application prospects in the field of Traditional Chinese Medicine.

Ophiopogonjaponicus;Adulterants;ITS2;Molecular identification;DNA barcoding

*黄林芳,Tel： (010)57833197,E-mail：lfhuang@implad.ac.cn

2011-11-23)