黄骥，宋治远，张倩

心肌细胞电传导主要依靠缝隙连接(gap junction，GJ)来完成。窦房结作为心脏的起搏活动中心，其GJ主要起到维持规律的激动频率以及传导激动到心房的作用［1］，目前，构成 GJ的缝隙连接蛋白(connexin，Cx)在原代培养乳鼠窦房结细胞中如何表达尚不完全清楚［2-3］。本研究旨在探讨原代培养乳鼠窦房结细胞及心房肌细胞中不同Cx的表达及其差异，为后续研究打下基础。

1 材料与方法

1.1实验动物出生24 h内的Wistar乳鼠，雌雄不拘，由第三军医大学实验动物中心提供。

1.2仪器和试剂激光共聚焦显微镜(Leica公司)、羊抗人Connexin43多克隆抗体、羊抗人Connexin45多克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔抗鼠Connexin40多克隆抗体(ADI公司)、SABC-FITC试剂盒和SABC-Cy3试剂盒(武汉博士德公司)、4%多聚甲醛液(北京益利精细化学品有限公司)。

1.3乳鼠窦房结细胞原代培养按本实验室建立的原代乳鼠窦房结细胞培养方法进行［4-5］。

1.4实验分组取培养48 h的乳鼠窦房结细胞进行Cx45、Cx43及 Cx40检测，随机分为 Cx45组、Cx43组、Cx40组。另取培养48 h乳鼠心房肌细胞进行培养，作为对照组，随机分为Cx45组、Cx43组、Cx40组。1.5免疫细胞化学处理①每孔细胞用4%多聚甲醛2 ml在室温下固定30 min，吸出固定液，用PBS液清洗5 min×3次。②每孔中滴加1:20的PBS液稀释的正常兔血清封闭液1 ml，室温20 min。甩去多余液体，不洗。③滴加适当稀释的一抗，4℃过夜。PBS液洗10 min×3次(不同的一抗实验选择相同的一抗浓度，分别是Cx45为1:300、Cx43为1:300和Cx40为1:300)。④滴加二抗(1:100)，37℃30 min，PBS液洗10 min×3次。⑤滴加试剂 SABCFITC 或 SABC-Cy3(1:100 PBS)，37℃ 孵育 30 min，PBS液洗10 min×3次。⑥30%缓冲甘油封片;以上操作均避光进行。随机取细胞爬片中央区20个梭形细胞作为研究对象。实验时Cx45用FITC荧光标记，Cx43用Cy3标记，Cx40用FITC标记。

1.6激光共聚焦检测用激光共聚焦显微镜(Leica，TCS，NT)对经免疫细胞化学法处理的原代培养乳鼠细胞进行检测。FITC在490～495 nm激化，在520～530 nm发射黄禄色，呈荧光。Cy3在554 nm激化，在568～574 nm发射鲜红色，呈现荧光。用于图像采集的显微镜物镜为40×油镜，数值孔径为1.3，主要参数如下:小孔孔径225 μm，X轴扫描点数400，Y 轴扫描点数400，扫描步径0.6 μm，扫描强度55%，激光强度300 mW。

多通道扫描记录每个图像(512×512像素)。每个细胞用相同的一抗和二抗浓度，并用同样的扫描参数扫描。每个细胞分层扫描(20层)及荧光信号叠加形成图像，荧光定量数据由激光共聚焦显微镜自带Quantify software采集分析所得。Cx荧光强度阳性定义为在0～255灰阶强度中超过其阈值50［6］，Cx 定量如［7，9］文献所述，将数字化图像储存于计算机，待实验结束后进行图像分析。

1.7统计学处理采用统计软件SPSS 10.0进行统计学处理，计量资料以(s)表示，两组均数的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1原代培养乳鼠窦房结细胞Cx的分布用激光共聚焦显微镜对经免疫细胞化学法处理的乳鼠窦房结细胞检测发现，Cx45免疫信号主要分布在胞膜上，表现为大小不一、不连续的荧光团、斑片状或散在的荧光点，在胞浆中有微量的分布(图1);Cx43免疫信号也主要分布在胞膜上，呈不连续的、大小不一的荧光点或斑片状，细胞浆中仅微量的信号表达(图2);Cx40免疫信号分布少，为大小不一、不连续的荧光点散在于胞膜上，而胞浆中几乎没有分布(图3)。

2.2原代培养乳鼠心房肌细胞Cx的分布用激光共聚焦显微镜对经免疫细胞化学法处理的乳鼠心房肌细胞检测发现，心房肌细胞以Cx40分布最为明显，主要在胞膜上，呈不连续的、大小不一的荧光点或斑片状分布，胞浆中仅有微量的信号分布(图4);心房肌细胞Cx45及Cx43的分布稀少，在胞膜上呈不连续的、大小不一的荧光点或荧光斑片(图5、6)。2.3免疫荧光定量分析免疫荧光定量分析显示，乳鼠窦房结细胞Cx45免疫信号比心房肌细胞中高7.8倍(P＜0.01)，而Cx40的免疫信号则较心房肌细胞低4.0倍(P＜0.01)(表1)。

3 讨论

图1 乳鼠窦房结细胞Cx45的表达 图2 乳鼠窦房结细胞Cx43的表达 图3 乳鼠窦房结细胞Cx40的表达

图4 乳鼠心房肌细胞Cx40的表达 图5 乳鼠心房肌细胞Cx43的表达 图6 乳鼠心房肌细胞Cx45的表达

表1 原代培养乳鼠窦房结细胞和心房肌细胞Cx表达的比较(s，n=10)

表1 原代培养乳鼠窦房结细胞和心房肌细胞Cx表达的比较(s，n=10)

注:与心房肌细胞比较，aP＜0.01

Cx45 Cx43 Cx40窦房结细胞 86.46±5.76a 40.38±2.76 18.44±3.12组别a心房肌细胞10.28±2.13 26.34±4.86 65.25±7.86

缝隙连接(GJ)广泛分布于各种动物组织细胞之间，偶联细胞间相互通讯，包括电偶联和代谢偶联。由缝隙连接蛋白(Cx)组成的GJ形成细胞间的通道，介导激动从窦房结到达心肌细胞。心肌细胞各种Cx分布有区域性变化，这有助于正常心肌激动传导的各向异性和心房、心室规则的收缩和舒张。

研究发现窦房结中Cx的种类和量的多少与结内实质细胞的不均一性分布有关［10］。从窦房结的中心到周边，细胞形态是逐渐改变的，其中出现了过渡细胞(既像P细胞又像心房肌细胞)。由窦房结中央到边缘，上述三种Cx的种类和量的多少并不一致［11］。位于窦房结中心的P细胞被认为是典型的起搏细胞，这种细胞不仅小并且“空”，由于窦房结结构上的不均一性，大多数对窦房结细胞的研究未区分窦房结中央区和外周区细胞，均推测研究的都是中央区细胞。本实验室以前的研究经过形态及电生理检查证明我们培养的原代乳鼠窦房结细胞中的梭形细胞可能就是中央区P细胞［4-5］。

对多种动物研究发现，Cx45主要分布在窦房结和心脏传导系统［9，12］。本研究发现原代培养乳鼠窦房结细胞中Cx45的信号强度是心房肌细胞的7.8倍，这一结果支持在乳鼠窦房结细胞中主要表达Cx45的结论［2］。本研究同时还发现对照组乳鼠心房肌细胞Cx45表达为阴性，与国内的报道是一致的［12］。

多数研究认为在窦房结中至少在中央区细胞中Cx43是不存在的［13］。但是本研究发现在原代培养的乳鼠窦房结细胞中有Cx43中量表达，与以前的文献报告结果不同，其原因可能为:①动物种属的区别;②本研究用新生的乳鼠进行研究，而大鼠Cx43在不同的发育阶段其表达是有改变的(即增龄性改变)，而在新生鼠中表达可能较高［6，10］;③可能与使用的单克隆抗体或多克隆抗体有关;④没有免疫标记并不意味着就不存在，这是因为窦房结中GJ可能本来就小，如果小到超过免疫标记的底线就不会有表达;⑤从功能上讲，Cx43与Cx45在窦房结细胞间形成异质性通道，更有利于窦房结中央区向外周的电传导［14］，故提示不同种动物的不同组织由于功能不同，其Cx组成的GJ具有不同的组成。

文献报道Cx43在乳鼠心房肌细胞表达较弱，与本研究结果相似［15-16］。现有研究发现心房肌细胞中主要表达Cx40［17］，本研究也显示对照组心房肌细胞Cx40表达丰富，是窦房结细胞的4倍，表明Cx40是乳鼠心房肌细胞主要的Cx。

近年来，用免疫电镜、免疫荧光、电生理技术等均证实窦房结内有 GJ和 Cx［1，6-7］，本研究结果也支持在窦房结组织中存在GJ的观点，此可能与窦房结细胞中桥粒等闰盘力学结构可能不发达，而电学结构相对完善的特性有关。

当细胞分离培养时，GJ不会分解而是保存其完整结构，只是在膜上快速封闭而维持在膜上的位置。在兔心肌细胞中表面连接无胞吞作用，也无GJ泡［17］的移动，且长达 22 h 也无新的 GJ形成［18］。因此，可以想象在细胞分离培养时，GJ仍保持稳定。本研究采用原代培养的乳鼠窦房结细胞，不是急性分离的细胞，从分离、培养到固定的时间长于急性分离实验。培养的心肌细胞中，Cx和GJ的分布与培养的时间有关［19］，本研究采用培养48 h这个时间点，在大鼠的心室肌细胞中已证明能使Cx位于细胞膜上，且心肌细胞中Cx是一致地分布于闰盘。故根据在普通心肌细胞上的资料，推测在原代培养的乳鼠窦房结细胞中GJ将接近原来的位置而得到保存。在激光共聚焦检查时，荧光点的部位能够反映GJ的原始分布和它们的Cx组成。但很明显，细胞的分离过程可能会改变Cx的表达，单个细胞上GJ和Cx的数目可能要少于急性分离的细胞，更少于完整组织中拥有的GJ数目。

综上，在原代培养乳鼠窦房结细胞和心房肌细胞中研究了Cx45、Cx43和Cx40的表达，发现乳鼠窦房结细胞中以Cx45表达为主，而心房肌细胞主要是Cx40表达，为更进一步了解窦房结的生理功能提供帮助。

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