王 萌 ，杨 柳 ，杨风蕊 ，阎 嘉 ，孟 林

（1.天津医科大学药理学教研室，天津300070；2.天坛生物制品股份有限公司，北京100024）

东北鹤虱（Lappula Echinata Gilib，LEG）为紫草科植物东北鹤虱的果实，盛产于我国华北、东北等地区。药书记载，其味苦、辛、平，入脾、胃、肝三经，可治疗虫积腹痛[1]，民间用其果实或全草水煎治疗各种腹疼、腹泻，尤其对慢性、迁延性腹泻有独到的疗效。前期研究证明其提取物LEGPS-Ⅱ对淋巴细胞及巨噬细胞功能有增强或调节作用[2-3]，本文旨在研究该提取物对小鼠巨噬细胞氧化损伤是否有保护作用，进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和药物 LEG产地为我国黑龙江省，种子类药材，呈卵形，长约3～3.5mm，由黑龙江中医药大学药学院药用植物学教研室于加宾教授鉴定。取干燥的LEG，粉碎至20目，水煎煮，过滤除药渣后合并药液，以水提醇沉法及Sevag法收集并除蛋白，得到粉末状淡黄色提取物LEG-I。LEG-I经阴离子交换柱层析再浓缩透析冻干得东北鹤虱提取物（LEGPS-Ⅱ），淡黄色粉末，易溶于水，纯度为38.7%。药物用PBS缓冲液配制成1mg/mL储备液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存，临用前用PBS缓冲液稀释成所需浓度。

RPMI-1640培养液，北京天润善达生物科技有限公司；超级新生牛血清，美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyl tetrazole,MTT），瑞士 Fluka公司；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO），美国Amresco公司；一氧化氮（NO）测试盒(硝酸还原酶法)，南京建成生物研究所，批号20101229；分型一氧化氮合成酶（NOS）测试盒，南京建成生物研究所，批号20101220；BCA蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术研究所；总超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20110104；微量丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20101228。

1.1.2 实验动物 近交系清洁级昆明种小鼠，体质量均为（20±0.25）g，4～6 周龄，雌雄不拘，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（批准文号：SCXK-2010-003），实验前置动物于室内适应环境1周，不限食水，室温18～22℃，相对湿度50%～70%。

1.1.3 仪器 SW-CJ-1F型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；Forma SeriesⅡ型二氧化碳孵箱（Thermo Electron Corporation）；CK40生物倒置显微镜（Olympus）；Model680型酶标仪（Bio-Rad）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BFX5-320型低速自动平衡离心机（白洋离心机厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 昆明种小鼠1只，颈椎脱臼处死，完全浸入75%酒精内消毒5min后取出，移入超净台内固定其四肢。小鼠腹腔内注入冷PBS缓冲液5mL，轻揉腹部5min后，用眼科剪小心剪开腹部皮肤，暴露腹膜。于腹膜上剪一小口，用无菌吸管深入腹腔内吸回PBS液。将吸出液离心1 500 r/min 10min后弃上清，用含10%超级新生牛血清的RPMI-1640完全培养液重悬沉淀。台盼蓝测定细胞存活率为90%以上，计数，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×106/mL。无菌条件下收集正常小鼠腹腔MΦ悬液完毕。

1.2.2 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响 RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×106/mL接种于96孔板，将培养的细胞分为5组：正常对照组：加入等量培养液，不加任何药物；HO损伤组：加入终浓度0.2mmol/L的H2O2作用0.5 h；LEGPS-Ⅱ（30，60，120 μg/mL）保护组：分别加入不同浓度的LEGPS-Ⅱ孵育3 h后加入0.2mmol/L的H2O2，继续孵育0.5 h。每个浓度组设重复孔6个，37℃二氧化碳培养箱培养，后弃原培养基，各孔加入含MTT 20μL（终浓度0.5mg/L）的培养基继续培养4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入100μLDMSO，震荡5min，用酶标仪于570 nm波长处测定吸光度值，以 OD测定组/OD对照组×100%计算细胞存活率。

1.2.3 NO、T-SOD、MDA的测定 实验分组同上，指标测定按南京建成生物工程研究所试剂盒方法操作。

1.2.4 诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的测定 将巨噬细胞接种于6孔板中，实验分组同上，用细胞刮将细胞刮下，将培养液在室温条件下1 000 r/min离心10min，弃上清留细胞沉淀。在细胞沉淀中加入0.5～1mL的生理盐水（等渗），轻轻颠倒混匀，将培养液在室温条件下1 000 r/min离心10min，弃上清留细胞沉淀。重复这一操作1～2次。超声破碎细胞，功率300W，每3~5 s超声1次，间隔4次（每次间隔时间30 s～1min），超声过程中保证冰水浴。最后1 000 r/min离心10min，所得上清即为样品。样品按南京建成生物工程研究所试剂盒方法操作。

1.3 统计学方法 实验数据应用SPSS17.0统计软件进行处理，结果均以形式表示。多样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA），方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Dunnett’s T3法检验。

2 结果

2.1 LEGPS-Ⅱ对H2O2损伤的巨噬细胞存活率的影响 见图1。

与对照组比较，H2O2处理使细胞存活率明显降低（P<0.01）；与H O 组比较，LEGPS-Ⅱ各浓度组均显著提高细胞存活率（P<0.05，P<0.01），且各给药组之间差异也有显著性（P<0.05，P<0.01）。

2.2 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞NO及其合酶的影响 与对照组相比，H2O2损伤组NO的含量增加1倍以上（P<0.01）、iNOS活力提高2倍（P<0.01）；与H2O2组相比，LEGPS-Ⅱ各浓度组均使NO的含量降低（P<0.05，P<0.01）、iNOS 的活力下降，且各组间存在统计学差异（P<0.05，P<0.01）。见图 2、3。

2.3 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞SOD的影响与对照组比较，H2O2处理使T-SOD活力显著降低（P<0.01）；与H2O2组相比，LEGPS-Ⅱ各浓度组均显著提高T-SOD活力（P<0.05，P<0.01），但60μg/mL及120μg/mL LEGPS-Ⅱ给药组之间T-SOD活力差异无统计学意义。见图4。

2.4 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞MDA的影响 与对照组比较，H2O2处理使MDA含量明显升高（P<0.01)；与H2O2组相比，LEGPS-Ⅱ各组均显著降低MDA含量（P<0.01），且各组间均有统计学意义（P<0.01），见图 5。

3 讨论

自由基是一种含有不成对电子的原子、分子或基团。超氧阴离子O2-·、羟自由基·OH、过氧化氢H2O2等通常称为活性氧自由基（ROS）。NO是一种小分子气体，含有一个未配对的电子，因而具有自由基性质。NO·及其生物体内激发产物统称为活性氮自由基（RNS）。生理情况下机体产生的自由基很少并参与机体的多种生理生化过程，体内还存在抗自由基系统：一类是酶性防御系统，包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)等；另一类是非酶性防御系统，包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽（glutathione,GSH）[4-5]等。它们对清除自由基、保护细胞及机体正常生理功能起重要作用。氧化应激是指由于OFR过量生成或细胞内抗氧化防御系统受损，导致OFR及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。ROS和RNS均可引起氧化应激。

H2O2是一种重要的ROS，极易透过细胞膜，与细胞内铁离子通过反应形成高活性的自由基，导致一系列反应，其易于获得，性质相对稳定，所以它已成为研究细胞氧化损伤的重要工具。本实验以H2O2造成小鼠腹腔巨噬细胞的氧化应激状态，观察东北鹤虱提取物LEGPS-Ⅱ的抗氧化损伤作用[6]。

iNOS主要分布于巨噬细胞、肝细胞等，当受到某些细胞因子，如内毒素、白介素、脂多糖及干扰素刺激后而表达。NO是在iNOS催化下L-精氨酸生成L-瓜氨酸的反应中形成的小分子气体自由基，研究证实NO在各种炎性疾病病理过程中起重要作用，炎性反应时，主要由巨噬细胞生成NO。适量的NO有助于杀灭病原微生物、减轻炎性反应等，但过量的NO可与超氧阴离子（O2-）等氧自由基反应，表现为明显的细胞毒效应。本实验中，H2O2处理使巨噬细胞培养液中iNOS活力增加，NO含量明显升高，提示H2O2可引起巨噬细胞氧化损伤。在LEGPS-Ⅱ的干预下，iNOS活力明显降低，NO含量明显减少。由iNOS催化合成的NO是介导细胞毒性的NO的主要来源，刺激因素下细胞内iNOS是NO产生的重要限速酶[7-8]，提示LEGPS-Ⅱ可能是通过抑制iNOS表达从而抑制细胞内NO产生，因而发挥抗氧化作用。

SOD催化O2-歧化为O2和H2O2。此酶是已知抗氧化酶系中速率最快的抗氧化酶之一，Vmax约为2×109mol/Ls。SOD是生物体内清除自由基的首要物质，保护机体免受ROS损伤，其值可以间接反映机体清除ROS的能力[9]。本实验在H2O2诱导的巨噬细胞氧化损伤中，LEGPS-Ⅱ能提高巨噬细胞T-SOD活力，发挥抗氧化作用。

体内最重要的脂质过氧化代谢产物是MDA[10]，MDA为极活泼的交联剂，随即与磷脂酰乙醇胺交联成荧光色素，然后与蛋白质、肽类或脂质结合成难溶性的无生理活性的色素斑点，沉积于细胞内，称为脂褐素。因此MDA是反映机体ROS损害的指标，测试MDA的量不仅可反映机体内脂质过氧化的程度，而且可间接反映细胞受ROS攻击而损伤的程度[11-12]。本实验中，LEGPS-Ⅱ能降低H2O2损伤下巨噬细胞MDA的含量，减少脂质过氧化损伤。

本实验结果表明，东北鹤虱提取物LEGPS-Ⅱ对自由基具有清除作用，能抑制iNOS表达而减少细胞内NO产生，能减少脂质过氧化产物MDA的生成量,还能提高抗氧化酶SOD活性，表现出多种途径的抗氧化作用。东北鹤虱具有广泛的生物活性，而抗氧化损伤是其重要的作用机制之一。

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