王业柳，马 英，王润玲，王树青，徐为人

（1.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津药物研究院，天津市新药设计与发现重点实验室，天津300193）

糖尿病被列为继心血管疾病及肿瘤之后的第三大疾病，目前全世界糖尿病患者中大部分是2型糖尿病，因此研究新型抗2型糖尿病药迫在眉睫[1]。研究人员发现，过氧化物酶体增殖因子活化受体PPARs是一类配体调控的转录因子，有3种亚型：PPARα,PPAR γ,and PPARβ/δ。它们在治疗肥胖、血脂异常、高血压及胰岛素抵抗等方面起着至关重要的作用，因此成为备受关注的降糖靶点[2]。激动PPARα或PPARγ虽能提高胰岛素的敏感性，但单独使用还是会产生如体质量增加、液体积聚和肺水肿等副作用。双重受体激动剂不仅能促进代谢，还能减少单一受体激动剂所产生的副作用[3]，所以已经成为受人瞩目的新型抗2型糖尿病药。本研究旨在从drug-like数据库中筛选出潜在的PPARα/γ双重激动剂，并对其进行结构修饰从而设计出新的PPARα/γ双重激动剂。

1 材料与方法

1.1 受体结构的准备 蛋白结构预处理由Schrodinger Suite 2009[Schrodinger（2009）.Schr dinger,LLC,New York]软件中的Protein preparationwizard模块完成。将下载的PPAR-α和γ靶点晶体结构（PDB ID:1k71和1k74）[4]导入SchrodingerSuite2009，首先对蛋白质结构进行修正，参数设定为Assign bond orders（修正化学键），Add hydrogens（加氢），Treatmetals（处理金属离子），Cap terminiby adding ACE&NMA residues（修正N端和C端的残基结构错误），经处理后除去蛋白质晶体结构中的水分子和杂原子，只保留蛋白分子与原始配体。再对蛋白质结构进行优化，氢键优化参数为Samplewaterorientations，优化力场选择OPLS 2005[5]，以RMSD 0.5魡为收敛标准。以原始配体小分子GW409544为中心，大小为10魡×10魡×10魡生成对接盒子文件。盒子文件的选取对结果的正确性有很大的影响，所以本实验以晶体库中的PPAR γ（1k74）为例来验证对接方法和盒子文件的选择是否合理。把晶体结构中原始配体提取出来，对接到PPARγ（1k74）的配体结合区，再重新与晶体结构中的配体叠合比对。对接后的结构与配体原始结构的均方根偏差（RMSD）值为0.16魡。说明盒子文件能够适用模拟体系。以下的实验均采用这个盒子文件。

1.2 虚拟筛选 选取drug-like数据库100 000个小分子作为虚拟筛选对象。配体优化是在LigPre模块中完成的。小分子优化的力场为OPLS 2005，产生pH值7.0±2.0下的离子化状态，去盐，产生各种可能的互变异构体。将优化后的配体分别对入PPAR α/γ 的受体结合区，应用 Glide[6]模块“HTVS”（高通量虚拟筛选）评估蛋白质和配体的结合能力。接着将得分排在前的1 000个化合物分别对入PPARα/γ的受体结合区，应用“SP”（标准精度）采用柔性对接，柔性对接时要求考虑各种环的柔性情况，要求对接函数在打分时对非平面型的酰胺键构象进行罚分，其它参数为默认值。

1.3 结构修饰 “Core Hopping”[CombiGlide2.5（2009）Schrodinger LLC]模块具有替换片段和分子对接两大功能，所以成为从头药物设计的新技术。在“Core Hopping”过程中，第一步是定义模板化合物。首先定义需要替换的片段，这一任务由Define Combinationsstep完成。第二步需要定义受体盒子，这部分已在Receptor Grid Generation中介绍。第三部分准备分子片段，分子片段来自于drug-like数据库和ZINC数据库中的片段数据库。第四步把小分子片段连接到母核上，得到的结构对接到受体里。最后，依据对接得分进行筛选，得分的绝对值越大，配体与受体的亲和力越强，结合力越好。

1.4 分子动力学模拟 利用Gromacs4.0软件包将复合物放入正方体盒子中，加入简单点电荷水分子（SPC），并加入抗衡离子，使模拟体系达到电中性，离子在模型中自动排布。模拟采用NVT系综，使用v-rescale方法使系统温度保持在300 K，范德华相互作用截断半径为1.4 nm，静电相互作用采用PME算法。应用最陡下降法对所有体系进行1 000步能量优化。优化后，平衡体系：（1）限制重原子，等温等容平衡水。（2）等温等容平衡蛋白。（3）不限制任何原子，等温等压调整水盒子大小。（4）等温等压下进行10 ns非限制性分子动力学模拟。

1.5 ADME预测 Schrodinger Suite 2009软件中的QikProp[QikProp3.2（2009）Schrodinger LLC]模块可以预测化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。在QikProp模块中，分子自动成中性状态。在正常模式下，此模块可以分析油水分配系数，水溶性，毒性。本实验对 logPo/w、PSA、logS、PMDCK 进行预测。logPo/w指油水分布系数，改变药物的油水分布系数达到提高其生物利用度的目的；logS指水溶性，改变药物的水溶性提高药物在血液中转运速度；PSA指极化表面积，与膜渗透相关的另一个参数；PMDCK指狗肾细胞培养，与肠通透性有关的参数。

2 结果

2.1 PPARα/γ双重激动剂模型 本实验以ragalitazar一种新型的PPARα/γ双重激动剂为阳性对照药[7]。对接结果列于表1。从对接结果可以看出所设计的9个化合物结合能均强于ragalitazar。

表1 对接结果Tab 1 The resultsofdocking by Glide

图1为comp#4 A-B2-C1和ragalitazar与PPAR α（1k71）和 PPAR γ(1k74)结合模式图。由图中可以看出comp#4A-B2-C1和ragalitazar的酸性头部分与PPARα（或PPARγ）中的4个重要氨基酸残基 Ser280/Ser289，Tyr314/His323，Tyr464/Tyr473和His440/His449形成氢键。这些氨基酸残基与配体形成的氢键网络可以使AF-2螺旋稳定于一种构象，从而使PPAR处于激活构象，实现基因表达的调控。新设计的化合物因有大的疏水部分C而与疏水臂II形成更强的疏水作用。这使化合物的结合力与ragalitazar相比增强。comp#4与PPARα（1k71）和PPARγ（1k74）的对接得分分别是-14.09和-13.15，比ragalitazar-11.49和-12.29高出两个以上数量级。

2.2 虚拟筛选和结构修饰 通过对ZINC[8]数据库中的drug-like数据库进行虚拟筛选，得出ZINC06088083小分子与受体PPARα和PPARγ结合最好。ZINC06088083中的酸性头能与AF2螺旋区的 Tyr464（1k71）和 Tyr473（1k74）形成氢键，使其稳定于激活构象。而ZINC06088083的缺点是与受体的疏水臂匹配性差，所以需要进一步的结构修饰。具体修饰过程如图2所示：首先，在1H-pyrazole环上添加疏水分子片段以提高与受体的疏水臂的匹配性，找出3个优选片段C1、C2、C3；然后，对1H-pyrazole环进行替换旨在找到结合更强的片段，找出3个优选片段B1、B2、B3。这样就产生了1×3×3=9个化合物。

2.3 分子动力学模拟结果 本实验综合结合模式和对接得分选出comp#4 A-B2-C1作为代表做动力学模拟。对PPAR空载、PPAR-ragalitazar和PPAR-comp#4的蛋白质骨架进行RMSD测算。如图3所示PPARα/γ与comp#4很快达到了平衡状态。分别稳定于0.18 ns，0.22 ns。为了更好地观察受体结构的波动，对受体侧链进行RMSF测算，结果如图3所示。PPARα/γ与comp#4的AF-2螺旋区RMSF的波动和PPARα/γ与ragalitazar的波动有相似的波动趋势，显示出新化合物comp#4与ragalitazar有相似的结合AF-2螺旋的功能。

2.4 ADME预测结果 应用Schrodinger2009软件包中的QikProp模块对与药效相关的5个性质进行预测。结果如表2所示。新设计的化合物的logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范围内。

表2 ADME预测Tab 2 Physiochem icaldescriptorscalculated by QP

3 讨论

3.1 PPARα/γ双重激动剂的设计 PPARs的天然配体是脂肪酸类化合物，因此，激动剂与PPARs的结合位点几乎是疏水的。Y型受体结合区域的3个疏水臂产生的疏水作用是设计PPARs新激动剂的关键。PPAR受体结合区域由极性区、疏水区和亲水区组成。AF-2螺旋在极性区内。PPAR激动剂的酸性头与AF-2螺旋形成氢键，它的疏水尾与PPAR的疏水区和亲水区结合。这种结合方式稳定了AF-2螺旋区域构象。通过与配体的结合降低了AF-2的电子迁移率促进了电子夹的形成，实现基因表达的调控[9]。靶点的选择对化合物的设计起到至关重要的作用。从RCSB蛋白数据库下载中选择了PPARα和PPARγ两个代表性的受体结构（PDB ID 1k71和 1k74），选择这两个蛋白的原因如下：（1）这两个蛋白包含了相同的配体GW409544，它们与GW409544的结合力相似，但GW409544对PPARα受体的活性较弱。（2）这两个蛋白是人源[10]。ragalitazar是一种高效高选择性的PPARα/γ双重激动剂,它引发的PPARα生物活性是PPARα激动剂（WY-14643）的0.97倍，引发PPARγ生物活性是PPARγ激动剂（罗格列酮）的1.17倍[11]。ragalitazar的酸性头部分与PPARα（或PPARγ）中的4个重要氨基酸残基Ser280/Ser289,Tyr314/His323,Tyr464/Tyr473和His440/His449形成氢键，起到激动受体的作用。由图1可以看出comp#4与这4个重要氨基酸残基也形成了氢键，而本实验设计的化合物不仅能和这些关键残基形成氢键，还能与受体的疏水区形成疏水作用。这是本实验设计的化合物创新点所在。

3.2 PPARα/γ双重激动剂的分子动力学研究 分子动力模拟是应用生化分子体系力场及根据牛顿运动力学原理所发展的计算方法。系统中的粒子的运动有正确的物理依据。本实验比较了PPARα/γ与comp#4的AF-2螺旋区RMSF的波动和PPARα/γ与ragalitazar的波动，发现两者的波动趋势相近。进一步在理论上证明设计的化合物与已知的激动剂ragalitazar具有相似的功能。

3.3 ADME预测 现今，一个成功用作口服药物的化合物必须具有足够的水溶性以及和其临床药效相关的通透性。准确的ADME预测对进一步合成起到指导作用。本实验设计的化合物logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范围内。尽管logPo/w越高，结合能力越强，但不能过度的增强logPo/w水平，这样会导致药物在体内分布较差[12]。从表1可以得出所设计的化合物可以作为新药的目标化合物，为今后的研究奠定基础。

[1]Shearer B G,Billin A N.The next generation of PPAR drugs:Do we have the tools to find them[J].Biochim Biophys Acta,2007,1771（8）:1082

[2]Bénardeau A,Benz J,Binggeli A,et al.Aleglitazar,a new,potent,and balanced dual PPAR α/γ agonist for the treatment of type II diabetes[J].BioorgMed Chem Lett,2009,19（9）:2468

[3]Berger JP,Akiyama T E,Meinke PT.PPARs:therapeutic targets formetabolic disease[J].Trends PharmacolSci,2005,26（5）:244

[4]Issemann I,Prince R A,Tugwood JD.etal.The peroxisome proliferator-activated receptor:retinoid X receptor heterodimer is activated by fatty acidsand fibratehypolipidaemic drugs[J].JMol Endocrinol,1993,11（1）:37

[5]Oostenbrink C,Soares TA,VanderVegtN F,etal.Validation of the 53A6GROMOS force field[J].Eur Biophys J,2005,34（4）:273

[6]Halgren T A,Murphy R B,Friesner R A,et al.Glide:a new approach for rapid,accurate docking and scoring.2.Enrichment factors in database screening[J].JMed Chem,2004,47（7）:1750

[7]Sauerberg P,Pettersson I,Jeppesen L,et al.Novel tricyclic-alpha-alky-loxyphenyl propionic acids:dual PPAR alpha/gamma agonistswithhypolipidemicandantidiabeticactivity[J].JMed Chem,2002,45（ 4）:789

[8]Irwin JJ,Shoichet B K.ZINC--a free database of commercially available compounds for virtual screening[J].JChem Inf Model,2005,45（1）:177

[9]JiCG,Zhang JZ.Protein polarization is critical to stabilizing AF-2 and helix-2′domains in ligand binding to PPAR-gamma[J].JAm Chem Soc,2008,130（50）:17129

[10]Xu H E,LambertM H,Montana V G,etal.Molecular recognition of fatty acidsby peroxisome proliferator activated receptors[J].Mol Cell,1999,3（3）:397

[11]Ebdrup S,Pettersson I,Rasmussen H B,et al.Synthesis and biologicaland structuralcharacterizarion of thedualacting peroxisome proliferatoractivated α/γ agonistragaglitazar[J].JMed Chem,2003,46（ 8）:1306

[12]Markt P,Schuster D,Kirchmair J,et al.Pharmacophoremodeling and parallel screening for PPAR ligands[J].JComput Aided Mol Des,2007,21（10/11）:575