赫长胜 李源渊 岳洪义 薛 峰 刘 健

1.山东省青岛市胶州中心医院肝胆外科，山东青岛 266300；2.河北省保定市第一人民医院儿科，河北保定 071000

茵陈为菊科多年生草本植物滨蒿或茵陈蒿的干燥地上部分，具有清利湿热、利胆退黄之功效，是我国传统医学治疗黄疸的主要药物之一。近年来的研究结果显示，茵陈中含有多种有效成分及微量元素[1-2]，其中多糖是其主要组分之一，本文就茵陈多糖对梗阻性黄疸幼鼠肝脏纤维化损伤的保护作用进行研究，为中药茵陈的开发利用及梗阻性黄疸的临床资料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

茵陈多糖（本课题组自制），肝脏组织层粘连蛋白（laminin，LA）、透明质酸酶（hyaluronidase，HA）、Ⅲ型前胶原（Type Ⅲ pro collagen，PC-Ⅲ）及Ⅳ型胶原（typeⅣ collagen，Ⅳ-C）检测试剂盒（购自天津原子能公司），放射免疫计数器（购自天津原子能公司）。

1.2 动物及分组

Wistar大鼠40只，清洁级，雌雄不拘，3～4周龄，体重80～100 g，由河北联合大学医学实验动物中心提供，动物生产许可称号：SCXK（京）2009-0004。20℃左右室温条件下适应性喂养7 d后随机分为四组，对照组、模型组、茵陈多糖高剂量组（高剂量组）、茵陈多糖低剂量组（低剂量组），每组10只。

1.3 动物模型的建立与干预

模型组、高剂量组、低剂量组动物于造模前禁食12 h，禁水4 h，戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后，常规消毒腹部皮肤，行上腹正中切口，暴露并游离胆总管，用丝线将胆总管中上段双重结扎，而后关腹；对照组仅暴露并游离胆总管，不结扎。各组大鼠于术后当天起，分别给予相应的药物进行干预，高、低剂量干预组幼鼠鼠分别灌胃茵陈多糖0.8、0.4 mg/kg，每日1次，对照组、模型组大鼠灌胃同体积生理盐水，分笼饲养，自由进食饮水。

1.4 生化指标的检测

术后2周对相应组别的幼鼠以乙醚吸入麻醉后，剪开右颈部暴露颈静脉，行颈静脉取血，分离血清，按试剂盒说明书操作规程测定血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及总胆红素（total bilirubin，TBIL）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL）、直接胆红素（ndirect bilirubin，DBIL）含量。

1.5 肝组织匀浆制备

幼鼠处死后立即开腹采集肝脏标本，制备肝组织匀浆，冰盐水漂洗、剪碎，制备组织匀浆，匀浆介质（蒸馏水1 000 mL，pH 7.4，EDTA-2Na 0.01 mol/L，Tris-HCL 0.1 mmol/L，0.8%NaCl溶液，蔗糖0.01 mmol/L），组织匀浆后低温高速离心，上清液待测。

1.6 LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C 的检测

LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C检测采用放射免疫法，检测过程严格按照仪器及试剂使用说明书进行。

1.7 肝脏组织病理标本制备及观察

肝脏组织病理标本制备采用肝中叶组织，常规方法固定包埋，4 μm厚度切片，HE染色，100目光镜观察拍片。

1.8 统计学方法

数据处理采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠肝脏组织病理标本比较

对照组大鼠肝脏形粉褐色态饱满，边缘锐利，质地柔软，分叶清晰，镜检见肝脏组织结构清晰，肝小叶、汇管区及肝窦形态正常，分布均匀（图1A），模型组大鼠肝脏形态不规则，边缘圆钝，肝脏黄染，镜检可见肝脏小叶点片状坏死，肝小叶间隙增宽，纤维组织增生，窦间隙及肝窦中炎症细胞增多（图1B）。低剂量组及高剂量组肝脏形态规则，肝脏黄染及变形较模型组轻，光镜检查可见肝脏小叶坏死少见，肝小叶间隙增宽，纤维组织增生及炎症细胞浸润较模型组轻（图 1C、D）。

2.2 茵陈多糖对梗阻性黄疸幼鼠肝脏生化指标的影响

造模2周后，模型组、高、低剂量组幼鼠血清AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL 水平升高， 高、 低剂量组 AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL水平低于模型组 （P<0.05）， 高剂量组 TBIL、DBIL、IBIL水平低于低剂量组（P<0.05）。见表1。

2.3 茵陈多糖对梗阻性黄疸幼鼠肝组织匀浆中肝纤维化指标的影响

造模2周后，模型组大鼠血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C浓度高于对照组，低剂量组及高剂量组血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C浓度低于模型组（P<0.05），高剂量组血清HA及Ⅳ-C浓度低于低剂量组（P<0.05）。见表2。

3 讨论

梗阻性黄疸是临床的常见疾病，多由于胆道肿瘤、结石及先天性畸形导致的胆道梗阻引起，胆道梗阻后引起胆汁排泄障碍，胆道压力增高，继发胆汁分泌障碍，伴随胆道的压力增高，胆汁逆流入血，引起梗阻性黄疸及肝脏组织结构的损伤及胆色素代谢障碍，胆色素具有细胞毒性，梗阻性黄疸能够引起多器官功能及结构的损伤，其中以肝脏结构及功能损伤最为突出，严重者可以引起胆汁性肝纤维化及肝硬化，导致肝脏储备功能下降，甚至功能衰竭，因此梗阻性黄疸患者肝功能的保护及防止继发性的肝脏纤维化性损伤是梗阻性黄疸患者围术期治疗关键问题之一。

表1 各组幼鼠血清生化指标比较（±s，n=10）

表1 各组幼鼠血清生化指标比较（±s，n=10）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与高剂量组比较，■P<0.05

组别 AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L） IBIL（μmol/L） DBIL（μmol/L）对照组模型组高剂量组低剂量组83.41±9.67 699.46±72.38*496.34±52.81*#513.46±53.25*#39.98±4.88 269.98±30.78*149.51±16.28*#152.58±16.31*#4.39±0.54 227.46±23.18*87.38±9.38*#109.06±10.87*#■3.71±0.46 97.98±10.03*32.52±3.42*#46.54±4.72*#■3.79±0.47 64.38±6.52*29.78±3.05*#32.28±3.94*#

表2 各组幼鼠肝脏组织匀浆肝纤维化指标比较（±s，n=10，ng/mL）

表2 各组幼鼠肝脏组织匀浆肝纤维化指标比较（±s，n=10，ng/mL）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与高剂量组比较，■P<0.05

组别 LA HA PC-Ⅲ Ⅳ-C对照组模型组高剂量组低剂量组51.92±6.04 95.46±11.49*70.14±8.06*#77.29±9.13*#714.35±22.16 1 516.42±133.09*1 059.45±106.94*#1 256.42±117.09*#■68.42±9.25 138.46±11.54*80.02±8.79*#86.54±10.26*#29.28±5.14 54.29±6.02*28.50±5.16*#45.06±6.27*#■

茵陈是我国的传统中药，具有利胆退黄作用，以茵陈为主要成分的中药在黄疸的治疗中具有独特的作用，近年来的药理学研究结果显示，在茵陈中含有多种组分，其中多糖是有效的组分之一[3]。研究显示，茵陈的多糖组分具有抗氧化作用，能够清除DPPH等氧自由基[4]，减少组织及细胞的氧化损伤。氧自由基大量生成是梗阻性黄疸肝脏损伤原因之一，茵陈多糖的抗氧化作用可能是其发挥肝脏保护作用的机制之一。此外，研究表明[5-6]，多糖能降低肝纤维化鼠肝组织的胶原沉积，减少前胶原纤维的表达，改善肝纤维化，也能够通过抑制肝纤维化大鼠肝细胞的TGF-β表达和下调Smad 3的表达发挥抗肝脏纤维化作用。

笔者在研究中发现，给予茵陈多糖干预后，高、低剂量组幼鼠 AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL 水平低于模型组，说明茵陈多糖能够改善梗阻性黄疸大鼠的肝脏损伤，同时在高低剂量组之间TBIL、IBIL水平表现出明显的差异，说明茵陈多糖对梗阻性黄疸肝脏损伤的保护作用具有明显的量效关系。在进一步的研究中发现，梗阻性黄疸能够引起幼鼠的肝脏纤维化，在结扎胆总管2周后幼鼠的肝脏纤维化指标LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C均有不同程度提高，低剂量组及高剂量组血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C浓度低于模型组，而且在高低剂量组之间也存在显著差异，说明茵陈多糖能够减轻梗阻性黄疸引起的肝脏损伤，改善肝脏纤维化。

[1]石玉平，冯瑛，王永宁，等.微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定藏茵陈中的微量元素[J].化学试剂，2000，33（11）：1019-1020，1044.

[2]胡彦武，关颖丽，姚慧敏，等.野生绵茵陈和花茵陈中绿原酸含量的比较[J].中国实验方剂学，2011，17（9）：78-80.

[3]刘晓河，梁惠花，谭晓红.茵陈中多糖的含量测定[J].中草药，2003，34（6）：519-520.

[4]戴喜末，熊子文，罗丽萍.响应面法优化野艾蒿多糖的超声波提取及其抗氧化性研究[J].食品科学，2011，32（8）：93-97.

[5]周程艳，艾凌艳，王美，等.杜仲多糖抗肝纤维化作用的实验研究[J].中草药，2011，42（2）：324-329.

[6]施磊，李俊，王佳佳，等.屏风多糖对大鼠肝纤维化保护作用的实验研究[J].安徽医科大学学报，2010，45（5）：651-654.