李涛，姜科声，阮琴，刘志强

1 浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004

2 浙江师范大学 行知学院，浙江 金华 321004

3 Department of Lymphoma and Myeloma, Division of Cancer Medicine, Center for Cancer Immunology Research, the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030, USA

生物技术与方法

重组nkx2.5腺病毒抑制过氧化氢诱导的H9c2细胞凋亡

李涛1，姜科声1，阮琴2，刘志强3

1 浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004

2 浙江师范大学 行知学院，浙江 金华 321004

3 Department of Lymphoma and Myeloma, Division of Cancer Medicine, Center for Cancer Immunology Research, the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030, USA

为研究心脏发育关键基因nkx2.5的功能及应用价值，构建Ad-Nkx2.5重组腺病毒，并检测nkx2.5过表达拮抗氧化应激损伤的效应及机制。采用AdEasy 腺病毒表达系统构建Ad-Nkx2.5重组腺病毒，建立H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡模型，分别用Ad-Nkx2.5重组病毒或对照病毒感染细胞，采用Hoechst33342染色观察细胞形态变化、MTT法检测细胞存活率，免疫印迹检测caspase-3活化、细胞色素C的胞浆含量。并通过Real-time PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax表达。结果发现，nkx2.5过表达促进 H9c2细胞存活，抑制 H2O2诱导的caspase-3活化及线粒体细胞色素C的释放。Nkx2.5过表达上调bcl-2表达，显著下调H2O2诱导的bax表达。并发现H2O2对Nkx2.5核定位无明显影响。结果显示重组腺病毒介导的Nkx2.5过表达可通过调控凋亡相关基因表达，抑制线粒体凋亡途径，保护心肌细胞抗氧化损伤。

Nkx2.5，重组腺病毒，过氧化氢，氧化应激，H9c2细胞，凋亡

Abstract:To study the function and potential application ofnkx2.5, a critical gene for heart development, we constructed a recombinant adenovirus overexpressingnkx2.5gene (Ad-Nkx2.5) with the AdEasy system. To evaluate the effect and mechanism of Ad-Nkx2.5 against oxidative injury, the H9c2 myocardial cells were infected with the recombinant adenoviruses Ad-Nkx2.5 or Ad-EGFP, and subsequently exposed to H2O2to induce apoptosis. The anti-apoptotic potential of Ad-Nkx2.5 was validated by MTT assay for cell viability, Hoechst33342 staining for cellular morphology, and immunoblotting for caspase-3 activity. Ad-Nkx2.5 infection led to an increased survival rate of H9c2 cells and decreased the amount of caspase-3 in an active form. Additionally, overexpression ofNkx2.5inhibited the release of cytochrome C from the mitochondria into the cytosol. Mechanismic studies showed that Nkx2.5 upregulatedbcl-2gene expression and significantly repressed H2O2-induced expression ofbaxdetected by Real-time PCR. Additionally, H2O2treatment did not affect the nuclear localization of Nkx2.5. These findings indicate that adenovirus-mediatednkx2.5gene transfer exerted a protective effect on H9c2 cells against H2O2-induced apoptosis via mitochondrial pathway, and the Nkx2.5-mediated expression modulation of apoptosis-associated genes could be involved in this event.

Keywords:Nkx2.5, recombinant adenovirus, hydrogen peroxide, oxidative stress, H9c2 cells, apoptosis

转录因子 Nkx2.5是关键的心肌发育调控因子，能够激活大量心肌特异性功能基因表达，参与心脏前体细胞的分化增殖、心脏的环化、房室分隔、房室流出道和传导系统的形成及成熟心脏正常功能的维持[1-2]。nkx2.5突变或表达异常将导致严重的心脏发育异常[3]。Nkx2.5另一重要功能为维持心肌细胞存活，抗缺血及凋亡[4-6]。研究发现野生型nkx2.5能够稳定乳鼠心肌细胞内稳态、拮抗过氧化氢和阿霉素引发的凋亡。当注射阿霉素以后，失活型nkx2.5的转基因小鼠出现严重的心脏功能异常，发生凋亡的心肌细胞明显增多；野生型nkx2.5基因转染后，能减轻阿霉素诱导的心肌损伤。

心肌缺血及再灌注过程中会产生大量氧自由基，造成心肌不可逆性的凋亡或坏死，并进一步演化为心力衰竭[7]。目前，正在探索通过干细胞移植治疗梗死性心脏病[8]。体外干细胞转入nkx2.5基因不仅有利于其特异性的向心肌诱导分化，也有利于提高移植细胞的存活率，改善心肌细胞功能[6]。nkx2.5有望成为心肌梗死等疾病的基因治疗分子。

但是 Nkx2.5拮抗心肌细胞凋亡的机制依然并不十分明确。本课题通过构建Nkx2.5过表达的重组腺病毒，包装病毒感染H9c2大鼠心肌细胞，并通过过氧化氢诱导凋亡模型，进一步研究阐释Nkx2.5拮抗心肌凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

pFLAG-Nkx2.5质粒由 Harvey RP教授(Victor Chang Cardiac Research Institute，Sydney，Australia) 惠赠。腺病毒穿梭质粒pAdTrackcmv、骨架质粒pAdEasy-1、JM109及BJ5183菌、HeLa及H9c2细胞均为本实验室保存。PmeⅠ及PacⅠ(NEB)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，质粒大量提取试剂盒 (Vigorous)。MMLV反转录酶、T4 DNA连接酶、T4多聚核苷酸激酶 (PNK) 均购自Promega公司；TaqDNA聚合酶和限制性内切酶购自New England Biolabs公司；蛋白酶K和DNA marker购自北京 TIANGEN公司；Hoechst33342和 G418购自 Sigma公司。抗Nkx2.5、细胞色素 C、GAPDH抗体购自 Santa Cruz公司，抗caspase-3抗体购自Cell signaling公司。[γ-32P] ATP购自北京亚辉生物医学工程公司。

1.2 质粒构建及腺病毒包装鉴定

腺病毒质粒构建及包装方法按文献报道[9]。将 pFLAG-Nkx2.5和腺病毒穿梭质粒pAdtrackcmv用BglⅡ和SalⅠ进行大量双酶切，建立Nkx2.5、pAdtrackcmv定向连接反应体系。重组pAdtractcmv-Nkx2.5质粒经PmeⅠ线性化后热休克转化含腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1的BJ5183感受态菌进行同源重组、卡那霉素筛选。经PacⅠ酶切鉴定正确重组的 pAd-Nkx2.5腺病毒质粒。pAd-Nkx2.5质粒DNA经PacⅠ酶切线性化后，按照Lipofectamine 2000说明书，转入293A细胞中进行病毒包装，倒置荧光显微镜下观察病毒噬斑的变化。待14 d后所有细胞感染病毒，变圆漂浮后，离心收集细胞，PBS漂洗后液氮反复冻融细胞3次，1000 r/min离心10 min后收集上清。倍比稀释后感染293A细胞，24 h后荧光显微镜观察，按公式：发荧光细胞数×稀释度/病毒液体积计算病毒滴度。对照空病毒为既往保存。

采用PCR法构建pEGFP-Nkx2.5质粒，使用引物如下：forward primer: 5¢-GCCGAATTC ATG TTCCCCAGCCCTG-3¢，reverse primer: 5¢-TAGG ATCC CAGGCTCGGATGCCGTGC-3¢。扩增片段插入pEGFP-N1质粒，测序正确后大提纯化。瞬转H9c2细胞后，加入G418 (400 mg/L) 筛选稳定克隆。

1.3 Western blotting检测蛋白表达

HeLa细胞或H9c2细胞接种于6孔板上，培养过夜后分别加入不同感染复数 (Multiplicity of infection，MOI) 的病毒液。经不同处理后弃培养液，提取蛋白，BCA法蛋白定量。30 μg蛋白煮沸后，12% SDS-PAGE电泳转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入抗Nkx2.5、caspase-3、细胞色素C (Cytochrome C) 或GAPDH抗体进行杂交，漂洗后辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，化学发光法进行显色反应。

1.4 凝胶阻滞 (EMSA) 检测Nkx2.5表达

按文献方法提取HeLa细胞核蛋白，建立体外反应体系[10]。北京奥科公司合成Nkx2.5特异识别的双链探针，正链序列如下：5¢-TCTTCTCA CACCTTTGAAGTG GGGGCCTCT-3¢。T4 多聚核苷酸激酶对探针进行末端32P标记。在每组反应混合物中，核蛋白用量为10 μg，用6%的非变性PAGE胶电泳，放射自显影显示Nkx2.5蛋白与探针DNA结合条带。

1.5 噻唑蓝 (MTT) 法检测H9c2相对活力

将H9c2细胞以1×105/孔接种至96孔板，以含100 mL/L胎牛血清，100 U/mL氨苄青霉素和100 mg/L链霉素的改良DMEM培养基培养。加入不同MOI的重组病毒感染细胞，24 h后加入H2O2至终浓度为200 µmol/L诱导细胞，于作用后 0、1、2、3、4、6、8、10和 12 h加入 10% 5 g/L MTT。37 ℃孵育4 h后，终止培养，弃去孔内培养液。每孔加入150 µL DMSO，低速振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔吸光值 (OD)。按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率 (%) = H2O2处理组OD值/非处理组OD值×100%。每组设4个复孔，实验重复3次。H2O2处理组与对照组相比，用配对t检验进行统计分析。

1.6 Hoechst33342染色及荧光观察

H9c2细胞加入终浓度为 1 mg/L的Hoechst33342避光染色30 min，PBS漂洗3次，细胞继续培养并进行下一步H2O2处理。H2O2处理6 h后在倒置荧光显微镜下观察各组细胞核形态变化，并结合EGFP染色观察细胞形态变化，拍照。

1.7 DNA ladder法检测DNA片段化

参照文献进行[11]，简述如下。1×107个H9c2细胞接种至培养皿中，以200 µmol/L H2O2诱导细胞。作用12 h收集全部细胞 (贴壁和非贴壁)，以细胞裂解液裂解细胞。0.1 g/L RNase A 37 ℃孵育1 h，0.2 g/L蛋白酶K 56 ℃孵育3 h。以酚/氯仿法抽提基因组DNA后溶解于TE缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.8 线粒体提取与细胞色素C检测

线粒体提取采用 Pierce公司试剂盒(Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells，89874)，简述如下。H9c2细胞(1×107) 经200 µmol/L H2O2处理6 h后，离心收集所有细胞。加入400 µL buffer A，涡旋振荡5 s，冰浴2 min，加入 5 µL buffer B 振荡，冰浴 5 min。加入 400 µL buffer C颠倒混匀，700×g低温离心10 min，取上清。12 000×g低温离心15 min，取上清即为胞浆蛋白。再将沉淀加入250 µL缓冲液C漂洗，12 000×g离心5 min，取沉淀即为线粒体，沉淀加入蛋白裂解液裂解得线粒体蛋白。BCA法测定各组分的蛋白浓度，Western blotting检测细胞色素c的含量。

1.9 Real-time PCR及RT-PCR

参照文献进行Real-time PCR[12]。H9c2细胞经200 µmol/L H2O2处理6 h后，收集所有细胞。按Trizol法提取细胞总RNA，随机引物法逆转录合成 cDNA第一条链。采用 TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix在ABI7700型定量PCR仪上进行PCR反应。测定样品的Ct值 (Cycle threshold，循环阈值) 通过计算 2-△△Ct来比较不同样品之间特定基因的表达差异。每个样本组均设定3个平行复孔，实验至少重复3次，以平均值±标准差的形式在柱状图中显示。RT-PCR在 T-gradientTMPCR仪(Biometra) 进行，引物退火温度为 58 ℃，循环数25～30。用于Real-time PCR及RT-PCR的引物序列见表1。

表1 Real-time PCR及RT-PCR使用引物Table 1 Primer sequences for Real-time PCR and RT-PCR

1.10 统计方法

数据以均值±标准差表示，采用 SPSS13.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异。

2 结果与分析

2.1 重组Nkx2.5腺病毒质粒的构建及鉴定

pFLAG-Nkx2.5质粒经BglⅡ和SalⅠ双酶切后，释放约1.1 kb的nkx2.5表达片段，再连入双酶切的pAdtrackcmv骨架质粒，克隆成功后酶切鉴定结果如图1A所示。pAdtrackcmv-Nkx2.5质粒经PmeI线性化，转入事先转入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌，进行同源重组，经卡那霉素筛选，重组克隆经PacI酶切鉴定。正确重组的质粒约33 kb，可切出约30 kb的片段及一个3.0或4.5 kb大小的片段。结果如图1B所示，可以发现重组体可切出一个4.5 kb大小的片段，pAd-Nkx2.5重组成功。

图1 pAd-Nkx2.5质粒的构建及鉴定Fig.1 Construction and identification of pAd-Nkx2.5 plasmid. (A) Identification of pAdtrackcmv-Nkx2.5 plasmid byBglⅡandSalI digestion. (B) Identification of pAd-Nkx2.5 plasmid byPacI digestion.

2.2 重组Nkx2.5腺病毒的包装及鉴定

将经过PacI线性化的pAd-Nkx2.5质粒转染293A细胞进行包装。荧光显微镜观察病毒噬斑，2 d起逐步出现噬斑，14 d左右有大量的病毒噬斑形成 (图 2A)，细胞大量表达 EGFP，形态变圆并且呈漂浮状态。收获细胞裂解释放病毒，倍比稀释法测定病毒滴度，重组Ad-Nkx2.5滴度为5×1011efu/mL (efu：expression-forming units)。按MOI=100感染 HeLa细胞。并提取 RNA进行RT-PCR检测nkx2.5表达，并通过Western blotting检测蛋白表达。结果如图 2B和 C所示，感染Ad-Nkx2.5的 HeLa细胞存在 Nkx2.5的 mRNA及蛋白表达，而感染对照病毒的细胞未检测到Nkx2.5表达。为了鉴定腺病毒载体表达的Nkx2.5蛋白是否具备完整的蛋白功能，又进行了EMSA实验。通过合成 Nkx2.5特异结合的 DNA探针(含保守结合序列TNNAGTG)，体外同位素标记后与感染病毒后提前的细胞核蛋白孵育，非变性PAGE分离后压片曝光。结果如图2D所示，感染 Ad-Nkx2.5的 HeLa细胞核蛋白能够与 DNA探针结合，而对照病毒组无特异条带。这表明重组腺病毒所表达的Nkx2.5蛋白具有正常的DNA结合能力。

2.3 Nkx2.5过表达保护H9c2细胞抗氧化损伤

Nkx2.5是重要的心肌调控转录因子。为了进一步研究 Nkx2.5的分子功能，我们运用Ad-Nkx2.5腺病毒感染大鼠心肌细胞系H9c2细胞，检测nkx2.5过表达对H9c2细胞凋亡的影响。H9c2细胞是来源于大鼠心室肌的心肌细胞系，在 H2O2等氧化刺激下能表现出典型的凋亡特征。H9c2细胞分别感染不同滴度Nkx2.5腺病毒(MOI分别为 0、25、50、100)，200 µmol/L H2O2处理细胞后通过MTT法检测细胞活力。结果显示如图3A所示，随着Nkx2.5腺病毒滴度增高，显著提高了细胞存活率。其中H2O2诱导12 h后，Ad-Nkx2.5最高剂量组 (MOI=100) 细胞损失率为 24.6%，Ad-Nkx2.5最低剂量组 (MOI=0) 细胞损失率则达 83.9% (P<0.01，n=4)。因此，后续实验均选择MOI=100的Ad-Nkx2.5病毒作为感染浓度。并以Ad-EGFP感染组为对照，其H2O2诱导12 h后细胞存活率为21.3%，而Ad-Nkx2.5组细胞存活率为72.9% (P<0.01，n=4) (图3B)。结果提示Nkx2.5过表达可以保护H9c2细胞拮抗H2O2诱导的氧化损伤。

图2 重组Nkx2.5腺病毒的包装及鉴定Fig.2 Packaging and identification of recombinant adenovirus overexpressing Nkx2.5. (A) Adenovirus plaque was monitored by fluorescence microscopy (100×). (B, C) Identification of Nkx2.5 expression in HeLa cells by RT-PCR (B)and Western blotting (C). (D) Overexpressed Nkx2.5 from HeLa cells infected with Ad-Nkx2.5 bound with specifec DNA probes in EMSA assay.

图3 Nkx2.5过表达保护H9c2细胞抗氧化损伤Fig.3 Overexpression of Nkx2.5 protects H9c2 cells against H2O2-induced oxidative injury. (A) H9c2 cell viability was evaluated by MTT assay after Ad-Nkx2.5 infection and subsequently H2O2(200 µmol/L) treatment. (B)Comparisons of cell viability between Ad-Nkx2.5 and Ad-EGFP groups. (C) Morphological changes were examined in H9c2 cells treated with H2O2(200 µmol/L) for 6 h. Arrows indicated typical apoptotic change, including cell shrinkage,blebbing, nuclear condensation and fragmentation (400×).

Ad-Easy腺病毒系统自带EGFP基因，细胞形态结构会被绿色荧光显色，同时采用Hoechest33342对细胞核荧光染色，即可对细胞凋亡时形态变化进行检测。结果可见，Ad-EGFP感染组在H2O2处理6 h后，即出现典型的凋亡表现：细胞皱缩变圆，细胞间连接消失，部分细胞发生脱落飘浮，细胞表面出现发芽起泡等形式的球形突起 (即凋亡小体)，核皱缩变小，密度增加，并发生浓缩碎裂 (图 3C)。随着时间推延，绿色荧光逐步消失，细胞崩解。而Ad-Nkx2.5感染组细胞形态及核形态大部分呈现正常状态，说明Nkx2.5过表达可抑制 H2O2诱导的 H9c2细胞凋亡。

2.4 Nkx2.5过表达拮抗线粒体凋亡途径

细胞凋亡有3种途径：线粒体途径，死亡受体途径和内质网途径。一般认为 H2O2所介导的氧化损伤激活线粒体凋亡途径。我们进一步验证Ad-Nkx2.5腺病毒感染拮抗H2O2所介导的H9c2细胞凋亡的相关机制。利用DNA ladder实验分析发现，H2O2诱导对照组细胞发生DNA片段化降解，形成以单个核小体和寡聚核小体为基础的梯形DNA条带，间距大小约为180～200 bp，为典型的凋亡特征 (图4A)。而感染Ad-Nkx2.5腺病毒的细胞未发现明显DNA ladder条带，表明Nkx2.5能够抑制 H2O2诱导细胞凋亡 (图 4A)。caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，无活性的procaspase-3以酶原 (32 kDa) 的形式存在于胞浆中，凋亡时切割为分子量分别为17 kDa和12 kDa的亚基而活化，进一步切割多聚 ADP-核糖聚合酶等底物蛋白。通过 Western blotting检测发现，Ad-Nkx2.5腺病毒感染拮抗H2O2所介导caspase-3剪切活化 (图4B)。为了判断Ad-Nkx2.5腺病毒能否抑制线粒体途径介导的凋亡，我们分别提取胞浆和线粒体蛋白进行Western blotting检测。结果如图4C所示，H2O2诱导对照组细胞线粒体功能障碍，细胞色素C由线粒体释放进入胞浆，而 Nkx2.5的过表达则稳定了线粒体功能，抑制细胞色素C释放。这些实验证据表明 Nkx2.5的过表达能够抑制线粒体途径介导的凋亡。

图4 Nkx2.5过表达抑制线粒体途径介导的H9c2细胞凋亡Fig.4 Overexpression of Nkx2.5 inhibits mitochondria-dependent apoptosis in H9c2 cells. (A) Overexpression of Nkx2.5 inhibited apoptotic DNA fragmentation (H2O2treatment for 12 h). (B, C) Overexpression of Nkx2.5 inhibited the caspase-3 activation (B) and release of cytochrome C from the mitochondria (C) (H2O2treatment for 6 h).

2.5 Nkx2.5过表达调控bcl-2和bax表达

Bcl-2与Bax共存于线粒体，组成离子通道，决定线粒体的通透性和功能稳定性。但Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，二者的相对比值对决定细胞是否凋亡起关键作用。为了进一步揭示Nkx2.5过表达抗凋亡的分子机制，提取 RNA进行对bcl-2和bax基因表达进行Real-time PCR检测。结果发现，Ad-Nkx2.5感染组与Ad-EGFP感染组比较，bcl-2基因表达水平增加了 1.59倍 (P<0.05)，同时bax基因表达水平则被抑制了44% (P<0.01)。但加入H2O2处理后，Ad-EGFP组bcl-2基因上调 1.35倍，Ad-Nkx2.5组bcl-2基因上调1.80倍 (P<0.01)；同时Ad-EGFP组bax基因上调7.39倍 (P<0.01)，Ad-Nkx2.5组bax基因上调 1.58倍 (P<0.01)(图5A和B)。说明Nkx2.5过表达可以显著抑制Bax基因高表达，从而抑制bcl-2/bax比值颠倒。同时Nkx2.5过表达对bcl-2基因表达具有一个弱的上调作用。这可能是Nkx2.5过表达保护H9c2细胞抗氧化损伤的分子机制之一。

图5 Nkx2.5过表达调控bcl-2和bax表达Fig.5 Overexpression of Nkx2.5 regulates the expression ofbcl-2andbaxgenes. (A and B) Real-time PCR was performed to assess the expression ofbcl-2(A)andbax(B) genes, when H9c2 cells were incubated with 200 µmol/L H2O2for 6 h. Untreated cells infected with Ad-EGFP were used as control group. All data were normalized togapdhmRNA level and showed with relative quantification. Each bar representsx±sfrom three independent experiments. *P<0.05,#P<0.01vsAd-EGFP group (with or without H2O2treatment).

2.6 Nkx2.5核定位不受氧化应激干扰

Nkx2.5是否正确定位与其抗凋亡功能密切相关，为了解H2O2诱导是否影响Nkx2.5定位，我们构建了表达Nkx2.5-EGFP融合蛋白的质粒，稳定转染H9c2细胞。结果发现Nkx2.5-EGFP蛋白定位于细胞核，并在H2O2处理后5 min至24 h内仍基本定位于核，未出现明显的核浆转运。但在已凋亡细胞的固缩核中，Nkx2.5-EGFP蛋白从弥散分布转为聚集散点状分布 (图6)。该结果显示Nkx2.5蛋白在氧化应激刺激下，核定位稳定，可能与其抗凋亡功能相关。

图6 H2O2对Nkx2.5核定位的影响Fig.6 The nuclear localization of Nkx2.5 in the absence and presence of H2O2. H9c2 cells stable-transfected with pEGFP-Nkx2.5 were incubated with 200 µmol/L H2O2for 24 h. The subcellular distribution of Nkx2.5-EGFP in H9c2 cells was analysed by fluorescence microscopy (400×). Hoechst staining indicated the morphological changes of cell nucleus during apoptosis.

3 讨论

Nkx2.5是重要的心肌分化和功能调控因子。本实验成功包装重组 Nkx2.5腺病毒，可应用于多个研究领域，如干细胞向心肌细胞的诱导分化、先天性心脏病及心律失常发病机制、抗心肌梗死、Nkx2.5分子功能研究等。

在探索提高体外不同来源的干细胞向心肌诱导分化效率时，证明了 Nkx2.5对于心肌的高效特异诱导。在P19畸胎瘤细胞中发现，过表达Nkx2.5可以让细胞摆脱对外源诱导剂 (DMSO)的依赖，细胞只要悬浮培养形成拟胚体即可高效率的分化为跳动的心肌细胞[1]。研究亦表明，Nkx2.5转染的骨髓干细胞能表现出部分心肌表型[6,13]。此外，筛选Nkx2.5表达阳性的心肌前体细胞加以扩增和诱导分化，也是目前研究热点之一[14-16]。通过nkx2.5转基因诱导干细胞向心肌分化，将为临床上先天性心脏病、心肌梗死、心功能不全等患者提供新的治疗手段，改善心功能。

同时，nkx2.5是第一个被检测出的法乐氏四联症及房室传导紊乱的致病相关基因。在人类的先天性心脏病图谱内，有数十种与nkx2.5突变相关的疾病，常见的表现型有房室间隔缺损、室间隔缺损、法乐氏四联症、右心室双出口，以及三尖瓣畸形导致的Ebstein氏畸形等[2,17-18]。nkx2.5突变还与房室传导阻滞等先天性畸形有关：nkx2.5单倍剂量不足使 QRS波时限明显延长，增强了心律失常易感性；而nkx2.5单等位基因敲除或心室部位特异性nkx2.5基因沉默则会导致由于房室结或房室束发育不足引起的房室传导缺陷[2]。通过nkx2.5转基因可能为部分房室传导阻滞患者提供基因补偿。

此外，nkx2.5转基因治疗亦可应用于心肌细胞缺损性疾病的治疗。心肌细胞凋亡可见于各种心脏疾病，如缺血性心肌梗死、高糖性心肌重构、蒽环类抗癌剂致心肌毒性。Nkx2.5能够稳定心肌细胞内稳态、拮抗过氧化氢、阿霉素诱导的超氧化物损伤和凋亡[4-6]。同时，研究显示Nkx2.5保持完整的结构对其介导抗凋亡作用是必需的。过表达Nkx2.5删除C端的突变体，发现抗凋亡的Bcl-xl蛋白表达下降，促凋亡的CAS蛋白增多，细胞更易受到如 H2O2、毒素或者营养缺乏导致的细胞损伤[5]。

但是 Nkx2.5抗凋亡的具体机制目前仍不是十分清楚。就另一心肌发育关键基因gata4而言，gata4能够直接上调抗凋亡基因bcl-2和bcl-xL表达[19-20]，而nkx2.5抗凋亡的下游靶基因则仍然未知。由于缺血性心肌梗死、高糖性心肌重构、蒽环类抗癌剂致心肌毒性，主要通过介导钙超载、氧自由基产生，经线粒体途径引发细胞凋亡。我们探讨了 Nkx2.5拮抗线粒体途径凋亡的分子机制。在本实验中，通过建立 H2O2诱导的 H9c2心肌细胞系凋亡模型，我们发现 Ad-Nkx2.5感染显著提高了细胞存活率，抑制了 DNA片段化和caspase-3的酶切活化。在线粒体途径介导的凋亡中，线粒体膜电位消失、通透性增加、细胞色素C释放是引发caspase-3活化的起始因素。我们的研究发现Nkx2.5过表达抑制了细胞色素C从线粒体的溢出，表明Nkx2.5具有稳定线粒体通透性和功能的作用。因此推测 Nkx2.5的下游靶基因可能与线粒体膜电位和通透性维持相关。

线粒体外膜的通透性主要受Bcl-2蛋白家族调控[12]。根据其功能可分为两大类：介导抗凋亡作用的bcl-2、bcl-xL、bcl-w等基因，及介导凋亡作用的bax、bad、bid、bnip3等基因。细胞接受凋亡信号后，Bax从胞浆转移到线粒体外膜，导致细胞色素C释放。而Bcl-2通过与Bax结合成异二聚体，阻止Bax的促凋亡作用。本研究发现，Nkx2.5能够上调bcl-2基因表达，下调Bax基因表达，特别是能够抑制氧化刺激引发的Bax基因超表达。提示bcl-2、bax基因可能是Nkx2.5的下游靶基因。但 Nkx2.5是否直接结合二者的启动子发挥转录调控作用，其具体结合位点等问题都有待进一步研究。特别值得指出的是，Nkx2.5通常作为一个转录激活因子而非抑制因子，其通过何种方式抑制bax基因表达将是一个有趣的问题。

此外，我们观察到 Nkx2.5的核定位性质相当稳定，即使细胞遭受H2O2刺激，其核内Nkx2.5蛋白仍基本定位于核，并未出现显著地出核现象。这一性质可能与其抗凋亡能力相关，能保证Nkx2.5蛋白在适量氧化刺激下仍正常执行转录调控功能而不会轻易失活。这也显示了其作为基因治疗候选分子的另一优势。

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Recombinant adenovirus overexpressingnkx2.5protects H9c2 cells against H2O2-induced apoptosis

Tao Li1, Kesheng Jiang1, Qin Ruan2, and Zhiqiang Liu3

1Chemistry and Life Science College,Zhejiang Normal University,Jinhua321004,Zhejiang,China
2Xingzhi College,Zhejiang Normal University,Jinhua321004,Zhejiang,China
3Department of Lymphoma and Myeloma,Division of Cancer Medicine,Center for Cancer Immunology Research,the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center,Houston,Texas77030,USA

李涛, 姜科声, 阮琴, 等. 重组nkx2.5腺病毒抑制过氧化氢诱导的H9c2细胞凋亡. 生物工程学报, 2012, 28(10): 1253−1264.

Li T, Jiang KS, Ruan Q, et al. Recombinant adenovirus overexpressingnkx2.5protects H9c2 cells against H2O2-induced apoptosis. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1253−1264.

Received:April 1, 2012;Accepted:June 8, 2012

Supported by:National Natural Sciences Foundation of China (No. 31101057), Youth Foundation of Zhejiang Normal University (No.KYJ06Y10191).

Corresponding author:Tao Li. Tel/ Fax: +86-579-82282269; E-mail: litao@zjnu.cn

国家自然科学基金 (No. 31101057)，浙江师范大学青年基金 (No. KYJ06Y10191) 资助。