李佩菡，向太和，谢军，冯婷，陆文怡

杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036

农业生物技术

转哺乳动物cyp2e1基因烟草植株再生及其分析

李佩菡，向太和，谢军，冯婷，陆文怡

杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036

哺乳动物肝细胞中cyp2e1基因所编码的蛋白CYP2E1在代谢异型有机物方面起着重要作用，转cyp2e1基因植物可以代谢多种小分子有机污染物；但cyp2e1基因在植物体内的表达调控和代谢机理尚不完全清楚。文中将含有cyp2e1基因的质粒pSLD50-6和对照gus基因的质粒pKH200转入根癌农杆菌GV3101，利用根癌农杆菌转基因技术将cyp2e1基因和对照gus基因成功转入烟草，分别获得了转cyp2e1和gus基因再生植株。选取PCR鉴定的再生植株进行荧光定量PCR (qRT-PCR) 分析，结果表明：在转录水平上，转cyp2e1基因烟草中，乙醇处理后cyp2e1基因的表达明显下降，苯和甲苯处理后cyp2e1基因的表达量稍有下降；而丙酮、甲醛处理和缺氧条件下cyp2e1基因的表达有不同程度的升高。此外，苯处理后，转cyp2e1基因烟草中NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5酶的基因活性显著提高，说明烟草中NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5酶与CYP2E1酶的解毒过程有关，可能起到哺乳动物体内的NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5的功能，参与CYP2E1酶催化过程的电子传递链。

烟草，cyp2e1基因，NADPH-P450酶，细胞色素b5，表达

Abstract:CYP2E1 enzyme encoded bycyp2e1gene plays an important role in metabolism of heterogeneous organics inmammalian liver cells. The transgenic plant withcyp2e1can metabolize various low molecular weight organic pollutants.However, it is unclear the mechanism of expression control ofcyp2e1in transgenic plant. In this study, plasmid pSLD50-6 withcyp2e1and pKH200 withgusas control were transformed intoAgrobacterium tumefaciensGV3101 separately. Then,thecyp2e1orgusgenes were transferred into tobacco (Nicotiana tabacum) and the transgenic plants were regenerated viaAgrobacterium tumefaciensmethod. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze thecyp2e1gene expression. The expression ofcyp2e1in transgenic tobacco withcyp2e1decreased obviously treated by ethyl alcohol and reduced slightly by benzene and toluene, while it enhanced by acetone, formaldehyde and oxygen deficit in different levels.In addition, the gene expression of NADPH-P450 oxidoreductase and cytochrome b5 enzyme in the transgenic tobacco withcyp2e1were increased significantly treated by benzene, which showed that NADPH-P450 oxidoreductase and cytochrome b5 enzyme in transgenic tobacco have relation with CYP2E1 detoxication process. It suggested that the NADPH-P450 oxidoreductase and cytochrome b5 enzyme in transgenic plant formed the requirement in mammalian and participated in the electron transport chain ofCYP2E1 enzyme catalytic process.

Keywords:tobacco (Nicotiana tabacum),cyp2e1gene, NADPH-P450 oxidoreductase, cytochrome b5, expression

细胞色素P450是一类与重金属结合的血红蛋白，在代谢异型有机物方面起着重要作用；其中，CYP2E1作为 P450酶家族中的成员之一，主要分布在哺乳动物肝脏中，具有非常重要的解毒功能[1-3]。美国华盛顿大学Doty课题组先后将细胞色素 P450 2E1基因 (cyp2e1) 转入到烟草Nicotiana tabacum、颠茄Atropa belladonna和杨树Hybrid poplar中，转基因烟草和杨树再生植株以及颠茄的毛状根能够高效分解苯、甲苯、三氯乙烯、三氯甲烷、四氯化碳和二氯乙烯等有机污染物[4-8]。Zhang等利用发根农杆菌转基因法，将cyp2e1基因转入花卉植物矮牵牛Petunia hybrida，转基因矮牵牛提高了对苯、甲苯的吸收能力，并提高了对甲醛的抗性[9]。

在哺乳动物体内，影响CYP2E1酶的因素有很多，其中它的诱导剂有乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、苯、甲苯、甲醛、吡唑和异烟肼等；此外，缺氧等环境因素诱导cyp2e1基因的表达，肥胖和患糖尿病时CYP2E1的活性增高[10-14]。而且，从代谢途径看，CYP2E1酶对异型有机物的代谢过程中，需要NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素 (Cytochrome) b5作为电子传递参与其中[15-17]；但cyp2e1基因在植物体内的表达调控和代谢机理尚不完全清楚[4,6]。

本研究利用根癌农杆菌转基因技术将cyp2e1基因转入烟草，分析了外源基因cyp2e1在转基因再生植物后代中的分离情况，并分析了不同环境因子对转基因植株的表达影响以及转基因烟草中植物内源性 NADPH-P450氧化还原酶和细胞色b5的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

烟草品种为黄苗榆。含有哺乳动物兔肝细胞cyp2e1基因的质粒pSLD50-6和含gus基因的质粒pKH200由华盛顿大学Doty博士友情惠赠。cyp2e1基因和gus基因均由35S启动子驱动，质粒pSLD50-6和pKH200都含有Kan (卡那霉素)抗性基因[6]。

1.2 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

烟草种子放入1.5 mL离心管中，用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次后，再用0.1%的升汞灭菌5 min，无菌水冲洗3次，最后用无菌的滤纸吸干种子表面水分，接种到MS固体培养基上。取萌发生长30 d后的无菌苗叶片作为转基因的受体。

通过冻融法将质粒pSLD50-6和pKH200分别转入根癌农杆菌GV3101。参考王琳和向太和的方法[18]，稍作改进，对烟草无菌苗叶片进行侵染转化，具体步骤是：1) 含cyp2e1的质粒pSLD50-6和含gus基因的质粒 pKH200的根癌农杆菌分别划线培养在LB+Kan 50 mg/L+Rif (利福平) 40 mg/L的培养基上，28 ℃培养。挑取单菌落过夜培养于LB+Kan 50 mg/L+Rif 40 mg/L的液体培养基中，28 ℃、200～250 r/min振荡培养。当农杆菌生长密度OD600约为0.5时，取1 mL菌液放入无菌的1.5 mL离心管中，离心，除上清，用MS液体培养基悬浮菌体并稀释至OD600约为0.1，用作侵染液。2) 将烟草无菌苗叶片切成约1 cm2的小块，用无菌的手术刀划出伤口，转入MS+0.5 mg/L 6-BA的培养基上预培养2～3 d。3) 将预培养的烟草叶片放在已制备好的农杆菌侵染液中，室温下80～100 r/min摇床振荡8 min。4) 用无菌的滤纸把烟草叶片表面的农杆菌菌液吸干，转入MS+0.5 mg/L 6-BA培养基上，共培养2～3 d。5) 共培养后的叶片放在MS+0.5 mg/L 6-BA +500 mg/L Cef (头孢霉素) 的液体培养基中振荡培养30 min，80～100 r/min；随后，用无菌的滤纸吸干液体，将叶片转入 MS+0.5 mg/L 6-BA +80 mg/L Kan+500 mg/L Cef的筛选培养基上；分化出的芽转移到不含任何植物激素的MS(0)培养基上生根。6) 再生植株生长到 5 cm以上后，打开培养瓶盖炼苗3 d，移栽装有培养土 (培养土的成分是草木灰∶蛭石∶珍珠岩，V/V=6∶3∶1) 的盆钵中，放入杭州师范大学人工气候室中生长。利用同样的方法获得对照烟草转gus基因的再生植株。

1.3 转基因烟草再生植株的鉴定分析

1.3.1 转基因烟草再生植株PCR分析

利用上海 Sangon公司的植物基因组提取试剂盒提取烟草的基因组DNA。根据cyp2e1基因(GenBank Accession No. M15061) 和gus基因(GenBank Accession No. AF354045) 序列，分别设计扩增cyp2e1基因和gus基因的引物：cyp2e1-P1：5¢-TGAAGGGTGTGCAGCCGATGA CAA-3¢，cyp2e1-P2：5¢-CATCGGGAATCTTCTCC AGTTGG-3¢和 gus-P1：5¢-CTGCGACGCTCAC ACCGAT-3¢，gus-P2：5¢-TCACCGAAGTTCATG CCAGTCCAG-3¢，引物由上海Sangon公司合成。PCR 扩增反应体积为 35 μL，其中包括 2 μL 0.1 mmol/L的 dNTPs (德国 Roche公司)，2 μL 10 pmol/L的PCR引物，2 UTaqDNA聚合酶 (美国Promega公司) 和约50 ng基因组DNA。用美国ABI公司PE9700型DNA扩增仪进行扩增反应。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃90s，30 个循环；72 ℃10 min，随后于4 ℃保存备用。扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳1.5 h (5 V/cm)，溴化乙锭 (EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。

1.3.2 转基因烟草再生植株cyp2e1基因的荧光定量PCR分析

用RNA提取试剂盒 (日本TaKaRa公司) 提取转cyp2e1和gus基因植株和对照非转基因植株叶片 mRNA，用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TaKaRa公司) 进行RT-PCR扩增。根据烟草actin基因序列 (GenBank Accession No. GQ339768) 设计引物 actin-F：5¢-CACGCCA TTCTTCGTTTGGA-3¢，actin-R：5¢-GGACAATT TCCCGTTCAGCAG-3¢，预期扩增长度为 112 bp，扩增结果作为内参。根据cyp2e1基因序列(GenBank Accession No. M15061) 设计引物

cyp2e1-F：5¢-ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGGA-3¢和 cyp2e1-R：5¢-TGTGGTTCAACAGCATCTCC C-3¢，预期扩增长度为 124 bp。用 ROCHE LIGHTCYCLER 480荧光定量 PCR仪进行cyp2e1基因的定量扩增分析。荧光定量PCR条件是：起始95 ℃ 2 min ；随后 95 ℃30s、59 ℃30s、72 ℃20s进行40个循环；结束后在4 ℃保存。参考 Livak和 Schmittgen的方法计算cyp2e1基因相对表达量[19]，即：相对表达量=2-ΔΔCt，其中Ct为样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。

1.3.3 Southern blotting

同 1.3.1中的方法大量提取转基因烟草植株基因组DNA，选用EcoRⅠ核酸内切酶对基因组DNA进行酶切后转膜。从质粒pSLD50-6中扩增cyp2e1基因的片段，扩增出的产物用上海Sangon公司DNA分离试剂盒进行纯化，再用Roche公司高效地高辛 DNA标记试剂盒 (DIG high prime) 制备探针，利用地高辛发光检测试剂盒(DIG luminescent detection kit) 进行杂交信号的检测，操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 Western blotting

利用 Roche公司蛋白抽提试剂盒抽提总蛋白质。取50 μL按照上海博彩生物科技有限公司BCA蛋白定量分析试剂盒说明书操作，进行蛋白定量。配制15%的分离胶和5%的浓缩胶。根据顺序加样，每个样品上样量为10 μg抽提蛋白，装入电泳槽中，打开电源，恒压100 V开始电泳，运行20 min；然后将电压调至180 V，运行60 min，取出胶进行转膜。

恒压30 V开始转膜，运行16 h，转膜结束后将膜放在5%脱脂奶粉中封闭，放入反应盒中备用。美国BD Genetest公司的CYP2E1酶鼠抗体用5%脱脂奶粉稀释 (1∶1 000)，加入反应盒中，室温缓摇2 h。用PBST洗去未结合的一抗，每次10 min，洗4次。二抗 (HRP) 用5%脱脂奶粉稀释 (1∶1 000)，加入反应盒中，室温缓摇1 h。用PBST洗去未结合的二抗，每次10 min，洗4次。在离心管中按照每1 mL ECL-PLUS显色液，加入膜上 (有蛋白的一面)，反应5 min，X-film曝光显色。

1.3.5cyp2e1基因在转基因烟草再生植株后代中的分离分析

再生植株自花授粉所结种子播于盆钵中，在人工气候室里种子萌发生长至2片真叶以上，取小植株 (T1代) 叶片同1.3.1的方法，提取基因组DNA和进行PCR扩增。

1.4 不同环境条件下转基因烟草cyp2e1基因的表达分析

在 20 mL的挥发性有机物分析瓶 (Volatile organic analysis vial，简称 VOA，美国 Aglient公司) 内盛放5 mL MS固体培养基，培养基中分别含有 8 µg/mL 乙醇、80 µg/mL 丙酮、10 µg/mL苯、10 µg/mL甲苯、50 µg/mL甲醛。乙醇等分别在高温高压灭菌的培养基冷却到50 ℃左右加入。剪取带2片叶的转基因苗，接入VOA瓶中，培养7 d后，取叶片提取mRNA。同时，培养在MS固体培养基上带2片叶的苗加入无菌水浸没过植株顶端进行缺氧处理 (水淹)，12 h后，提取叶片mRNA。荧光定量PCR检测cyp2e1基因的表达，荧光定量PCR方法同1.3.2。

1.5 转基因烟草中NADPH-P450氧化还原酶基因和细胞色素b5基因的表达分析

根据烟草 NADPH-P450氧化还原酶基因(GenBank Accession No. AB004307) 和cytochrome b5基因 (GenBank Accession No.X71441) 序列，设计荧光定量 PCR扩增引物：NADPH-F：5¢-CCCAAATGCCACACACATCA-3¢,NADPH-R：5¢-CCCAAGGAAAAGCCAAGCA-3¢和 b5-F：5¢-CTCCTCCCAATCAGCCTCATT-3¢，b5-R：5¢-GCCAAAAGCAACACCCAAAA-3¢，预期分别扩增出127 bp和124 bp长度的片段。同1.3.2的方法，以actin基因作为内参，进行荧光定量PCR分析。

在超净工作台上切取称量相同质量 (1g) 的转cyp2e1基因无菌苗叶片、对照转gus基因和非转基因烟草植株的叶片，放入含有MS培养基的VOA瓶中，在VOA瓶中用微量加样器加入苯，使培养基中苯终浓度达1 µg/mL苯，24 h后提取经过苯处理和未经过处理的叶片 mRNA，进行NADPH-P450氧化还原酶基因和细胞色素b5基因荧光定量PCR分析。

2 结果

2.1 转cyp2e1基因烟草植株再生

烟草无菌苗离体叶片在根癌农杆菌侵染30 d左右在筛选培养基上分化出单个芽或芽丛(图1A)。待再生芽长至2 cm以上切下转到MS(0)培养基上，在7 d左右即能生根 (图1B)。经过炼苗，移栽到含有培养土的盆钵中 (图 1C)，能正常生长 (图1D)，移栽100 d左右能开花结实(图 1E)。

2.2 转基因烟草再生植株的PCR鉴定

利用cyp2e1基因引物 cyp2e1-P1和cyp2e1-P2对获得再生植株进行PCR扩增。在获得的59株再生植株中，其中35株扩增出预期大小410 bp的条带 (图2)，初步确定cyp2e1基因成功转入烟草植株。

2.3 转cyp2e1基因烟草的荧光定量PCR分析

随机选取PCR检测阳性的4个株系 (TL01、TL03、TL15和TL26)、1株转gus基因烟草植株、1株野生型烟草进行目的基因cyp2e1实时荧光定量PCR分析，结果显示转gus基因植株和野生型植株均没有检测到cyp2e1基因的表达，而在转cyp2e1基因的4个株系中，外源cyp2e1基因均有不同程度的表达 (图3)。

2.4 Southern blotting和Western blotting分析

Southern blotting结果显示，转cyp2e1烟草4个株系TL01、TL03、TL15和TL26分别杂交出2个或2个以上的条带、对照野生型烟草和转gus基因烟草植株无杂交条带，说明外源基因以多拷贝的形式存在于转基因植株的基因组中(图 4)。Western blotting结果显示，4个株系TL01、TL03、TL15和TL26均杂交出预期大小56.2 kDa条带 (图5)，表明转入的外源基因在烟草中实现了正常编码表达。

图1 转cyp2e1基因烟草植株再生过程Fig.1 The transgenic plant withcyp2e1gene regeneration. (A) Buds differentiated from leaf. (B) Plantlet regeneration. (C) Plant transplanted in soil. (D) Plant growth normally in soil. (E) Plant flowering normally.

2.5cyp2e1基因在转基因后代中的分离情况分析

经过多重鉴定的 4个转基因株系 TL01、TL03、TL15和TL26均能正常开花，其中TL01、TL03和TL26自花正常结实，而TL15未能获得种子。经过PCR检测，cyp2e1基因在TL01、TL03和TL26 3个株系后代中出现了分离，其分离比分别是 51∶9 (17∶3) 、48∶12 (4∶1) 和 34∶26 (17∶13)，均不符合3∶1的比例，这可能与转基因植株基因组中外源基因是多拷贝以及外源基因插入的位置效应有关。已有不少报道指出在转基因植物后代中转入的外源基因异常分离的情况经常出现[20]。

图2 利用cyp2e1基因引物对烟草再生植株进行基因组DNA PCR扩增的结果Fig.2 PCR amplification of transgenic plant genomic DNA with primers fromcyp2e1gene. M: DSTM2000 DNA marker (Dongsheng Biotechnology Co.); 1:pSLD50-6 plasmid; 2: non-transgenic plant (wild-type);3−37: transgenic plants withcyp2e1gene.

图3 转cyp2e1基因烟草再生植株荧光定量PCR分析Fig.3 Real-time quantitative PCR analysis ofcyp2e1gene expression in transgenic plants. 1: non-transgenic plant (wild-type); 2: thetransgenic plants withgusgene;3−6: thecyp2e1transgenic plant individuals of TL01,TL03, TL15 and TL26.

图4 Southern blotting分析转cyp2e1烟草植株Fig.4 Southern blotting analysis ofcyp2e1transgenic plants. 1−4: thecyp2e1transgenic plant individuals of TL01, TL03, TL15 and TL26; 5: non-transgenic plant(wild-type); 6: thegustransgenic plants.

2.6 不同环境因子条件下cyp2e1基因的表达

选取cyp2e1基因表达量较高和较低的株系TL01和TL03放在分别含苯、甲苯、乙醇和丙酮的培养基中培养7 d、浸没水中12 h进行缺氧处理后，再对其进行荧光定量 PCR分析。两个株系的结果相一致，与对照相比，乙醇处理后cyp2e1基因的表达明显下降，苯和甲苯处理后cyp2e1基因的表达量稍有下降；而丙酮、甲醛处理和缺氧条件下cyp2e1基因的表达有不同程度的升高 (图6)。

图5 Western blotting分析转cyp2e1烟草植株Fig.5 Western blotting analysis ofcyp2e1transgenic plants. M: protein marker (MBI Co.); 1: non-transgenic plant (wild-type); 2: thegustransgenic plants; 3-6: thecyp2e1transgenic plant individuals of TL01, TL03,TL15 and TL26.

图6 不同环境因子条件下转基因植株cyp2e1基因的表达分析Fig.6 Expression ofcyp2e1gene of transgenic plant treated with different factors. 1: non-treatment; 2: treated with ethyl alcohol; 3: treated with acetone; 4: treated with formaldehyde; 5: treated with benzene; 6: treated with toluene; 7: treated with oxygen deficit.

2.7 转cyp2e1基因烟草NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5的表达分析

荧光定量 PCR分析结果显示，烟草内源性NADPH-P450氧化还原酶基因和细胞色素b5基因在野生型烟草、转gus烟草和转cyp2e1烟草中表达量没有明显差异。经过苯处理后，转cyp2e1烟草中 NADPH-P450氧化还原酶基因的表达显著升高，与野生型和转gus烟草相比提高达4倍以上；细胞色素b5基因表达量比野生型和转gus烟草升高2倍以上 (图7)。

图7 转cyp2e1基因烟草中NADPH-P450氧化还原酶基因和细胞色素b5基因表达情况Fig.7 Expression of NADPH-P450 oxidoreductase gene and cytochrome b5 gene incyp2e1transgenic plant. 1:non-transgenic plant (wild-type); 2: thegustransgenic plant; 3: thetransgenic plant TL01; 4: thetransgenic plant TL03;5: thetransgenic plant TL15; 6: thetransgenic plant TL26; 7: non-transgenic plants (wild-type) treated with benzene; 8:thegustransgenic plants treated with benzene; 9: thetransgenic plant TL01 treated with benzene; 10: thetransgenic plant TL03 treated with benzene; 11: thetransgenic plant TL15 treated with benzene; 12: thetransgenic plant TL26 treated with benzene.

3 讨论

CYP2E1作为 P450酶家族中的成员之一，存在于哺乳动物肝细胞中，对许多小分子有机化合物有分解能力[1-3]。cyp2e1基因在转基因植物体内表现出与动物体内相似的解毒功能，转cyp2e1基因烟草、颠茄、杨树和矮牵牛等提高了对苯、甲苯、氯仿 (三氯甲烷)、四氯化碳、三氯乙烯、二溴化乙烯、氯乙烯、溴二氯甲烷等有机小分子污染物的吸收分解能力[4-8]；并提高了对甲醛的抗性[9]，在植物环境修复中具有应用前景。此外，细胞色素P450基因家族的其他系列基因，如cyp1a1、cyp2b6和cyp2c19转入水稻后，提高了水稻对除草剂异丙甲草胺、莠去津的耐受能力，并且可以降低环境中的除草剂浓度[21]。

在哺乳动物包括人类中，P450基因的表达有多种调控方式，分为转录水平、加工和mRNA稳定以及翻译和酶稳定等调控类型。其中，cyp2e1的表达受乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、苯、甲苯、甲醛、吡唑和异烟肼等小分子有机物的诱导；并受缺氧、禁食、多尿症、肥胖和糖尿病等生理状态的诱导[10-14]。

本研究获得的转cyp2e1基因烟草，荧光定量PCR分析显示，在mRNA转录水平上，乙醇处理后cyp2e1基因的表达明显下降；苯和甲苯处理后cyp2e1基因的表达量稍有下降；而丙酮、甲醛处理和缺氧条件下cyp2e1基因的表达有不同程度的升高。其中，丙酮、甲醛和缺氧环境对cyp2e1基因表达的影响与哺乳动物相似，而乙醇、苯和甲苯对cyp2e1表达的影响与哺乳动物不同，即：在植物体内，外界因子对cyp2e1的调控与哺育动物体内不完全相同，这可能与植物和哺乳动物体内存在不同的调控系统有关。由于乙醇、丙酮是植物体内糖和脂肪代谢的中间产物，缺氧是植物胁迫环境的种类之一，苯、甲苯和甲醛是常见的环境污染物，因此，本研究结果可为调控和提高cyp2e1基因在转基因植物中的表达提供参考。

另外，在哺乳动物中，CYP2E1酶的催化过程需要电子传递链中 NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5的互作[15-17]。在转cyp2e1基因植物中，并没有同时转入哺乳动物体内的NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5基因，但在植物体内 CYP2E1酶同样具有分解小分子污染物的功能，这一直是个很不明确的问题[4,6]。本研究结果显示，苯处理后，转cyp2e1基因烟草NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5酶的基因活性显著提高，这说明烟草中内源性的NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素 b5酶与CYP2E1酶的解毒过程有关，可能起到哺乳动物体内的 NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素 b5的功能，参与CYP2E1酶催化过程的电子传递链。

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Transgenic plant regeneration of tobacco(Nicotiana tabacum)haboring mammaliancyp2e1gene

Peihan Li, Taihe Xiang, Jun Xie, Ting Feng, and Wenyi Lu

College of Life and Environment Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou310036,Zhejiang,China

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Received:January 16, 2012;Accepted:September 4, 2012

Supported by:Hangzhou Science and Technology Development Plan (No. 20091133B07).

Corresponding author:Taihe Xiang. Tel/Fax: +86-571-28865327; E-mail: xthcn@163.com

杭州市科技发展计划项目 (No. 20091133B07) 资助。