蔡玉笑，张志雯，秦素平，陈于和

(河北科技师范学院生命科技学院，河北秦皇岛，066600)

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术在检测基因表达中起到重要的作用，其检测结果灵敏性高，操作简便，已被广大科研人员所广泛应用［1，2］。但在具体操作过程中经常出现重复性不稳定的现象，这与引物的扩增效率有直接关系［3～6］。PPO包含2个铜离子保守结构域，由细胞核基因编码然后运输到质体中。PPO的活性部位主要在N-结构域，由酪氨酸修饰［7］。近年来，关于多酚氧化酶的生化特性和反应机理的报道很多［8］。在菌类中，人们报道了很多关于PPO抑制剂，及其在生物工程及生物技术中可能的临床应用［9，10］。另外，对于多酚氧化酶蛋白二级结构也有了新的研究，其结构酷似软体动物的血蓝蛋白［11］。同时，人们对多酚氧化酶活性和生物抗逆性也有了很深的认识，但在高粱幼苗中SbPPO的表达情况还不是很清楚，本试验对高粱BTx623幼苗中的SbPPO家族的表达模式进行了探索。

1 材料与方法

1．1 材料

挑选高粱品系BTx623籽粒大且饱满的种子，在室温下培养1周，提取总RNA，8种连有200～300 bp外源高粱多酚氧化酶基因的片段和一个Actin基因片段的pGEM-Teasy质粒作为模板，用每一质粒的特异引物进行扩增。

1．2 引物设计

利用软件Primer Premier 5在8个高粱籽粒多酚氧化酶基因和1个Actin基因的非保守区设计特异引物(表1)。

表1 特异引物

1．3 试剂

SYBR-Green购自Takara公司，Tripure购自罗氏公司，逆转录酶购自Promega公司。

1．4 质粒浓度稀释

将9种质粒分别先稀释到10－8ng/L。

分别各取2 μL质粒定容到20 μL，将质粒稀释到10－9ng/L。

同样的方法将9 种质粒分别稀释到 10－10，10－11，10－12ng/L。……