付广俊，王敏丽，刘 梅，龙 艳

（安徽农业大学，安徽 合肥 230036）

山茱萸为茱萸科茱萸属多年生木本植物，主要以果实入药，俗称山茱萸，又名山芋肉、药枣、实枣儿、枣皮、肉枣等，系名贵大宗药材[1]。山茱萸其性味酸，涩，微温，入肝肾两经，有补益肝肾，涩精固脱之功效，是中医临床中常用的一味药。山茱萸作为我国传统的名贵中药，具有多种化学成分和药理作用，故具有广阔的开发前景。据化学分析，山茱萸含有生理活性较强的山茱萸甙、酒石酸、没食子酸、苹果酸、树酯、鞣质和多种维生素等有效成分，具有抗菌消炎，降血脂，降血糖，抗癌，抗衰老，提高免疫力等作用[2-4]。

为了充分有效地利用山茱萸资源，笔者以山茱萸叶片、茎段、种子胚等作为外植体进行了诱导试验，筛选出生长迅速且质地疏松的诱导愈伤组织，并进行了继代培养过程中优化试验条件，旨在获得最佳的继代培养方法，为山茱萸的细胞悬浮培养，提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为山茱萸的幼嫩叶片、茎段、种子、成熟叶片等，采自于安徽省池州市石台县山茱萸生产基地。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒处理 选取无病虫害山茱萸的嫩叶、茎段和茎尖作为外植体进行组织培养，先用洗涤剂洗去表面灰尘，再用流水冲洗2 h。清洗后的材料在无菌的条件下，用0.1%HgCl2结合使用75%酒精进行不同时间的消毒处理[5]。放入75%酒精中消毒10~20 s，无菌水冲洗2~3遍，再放入0.1%HgCl2中消毒7~9 min，用无菌水冲洗5~6次。灭菌纸吸干水后接种在各种培养基上。种子先用75%酒精浸泡1 min，用0.1%HgCl2消毒5~6 min，再用无菌水冲洗3遍，切取种子中的胚接入无菌培养基上[6]，观察并记录培养状况。

1.2.2 培养条件 以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g/L、琼脂 7 g/L，pH 值为 5.6～6.0，以及不同浓度的激素 2，4-D，KT。培养温度为（25±2）℃，光照强度为2 000～3 000 lx，光照时间12 h/d 。

1.2.3 愈伤组织的诱导 将消毒处理后的无菌幼嫩叶片、老叶片、茎段作为外植体，其中叶片切成0.4 cm×0.4 cm的小块、茎段切成1 cm左右的小段，然后将不同的外植体接种于MS+2，4-D（1 mg/L）+KT（3 mg/L）培养基中进行愈伤组织诱导研究。每个处理20块左右，重复3次，25 d后进行继代培养。1.2.4 愈伤组织继代培养 选择质地均匀疏松度好的愈伤组织进行继代培养，把愈伤组织接种于不同条件的培养基中进行培养。继代培养一般5次以上，即可得到均匀、疏松、状态稳定的愈伤组织。每瓶愈伤组织接种量1 g左右，每组处理15瓶，重复3次。观察愈伤组织的生长状态、颜色以及疏松度等状况，计算其生长率。

1.2.5 诱导、继代培养考核指标 生长率（%）=（收获细胞量-接种细胞量）/接种细胞量×100%；死亡率（%）=（死亡外植体数/接种外植体数）×100% ；污染率（%）=（污染外植体数/接种外植体数）×100%；愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织外植体数/接种外植体数）×100%

2 结果与分析

2.1 山茱萸愈伤组织的诱导

2.1.1 不同激素浓度对山茱萸外植体的诱导效应将山茱萸嫩叶、老叶、茎段、无菌苗等接种到添加了不同组合浓度的KT+2，4-D的MS培养基上进行愈伤组织的诱导，接种外植体个数均为60，结果如表1所示。

表1 不同KT+2，4-D浓度对山茱萸叶片、茎段、无菌苗愈伤组织诱导率的影响

KT+2，4-D的组合均可以不同程度地诱导愈伤组织形成，KT（3 mg/L）+2，4-D（1 mg/L）组合对山茱萸的诱导效果最好，最高诱导率达80%以上。如图1所示，嫩叶片产生的愈伤组织较疏松，颜色浅，不易分化，这种愈伤组织在培养过程中，要及时进行继代培养，否则容易转变成灰褐色，产生褐变，直至死亡；茎段产生的愈伤组织一般比较坚实致密，继代培养过程中，颜色逐渐变为白色，结构坚实紧密，不易褐变；老叶片愈伤组织颜色呈浅黄色，结构坚实紧密，易褐变；无菌苗叶片愈伤组织颜色呈淡黄色，愈伤组织疏松易碎，继代培养中易褐变。无菌苗与老叶片不适合做继代培养，嫩叶片和茎段的愈伤组织都适合继代培养。

图1 山茱萸愈伤组织

2.1.2 消毒处理对外植体的污染控制比较 污染是指在组织培养过程中由于微生物的存在，使培养物生长受到影响或死亡的现象，所以控制污染是组培中的首要技术[7]。植物本身带菌是造成组织污染的关键因素，山茱萸外植体所带菌不易清涂，对山茱萸初代培养的影响巨大。采用0.1%的HgCl2和75%的酒精联合消毒，比较了不同消毒时间对污染控制的影响，接种数均为30，结果如表2所示。

表2 消毒处理对山茱萸不同外植体消毒效果的影响

由表2可知：接种1周后观察发现，以0.1%HgCl2消毒5 min的材料污染情况很严重，以75%乙醇消毒10 s和0.1%HgCl2消毒7 min时，材料污染较小。 将75%乙醇、0.1%HgCl2的消毒时间延长时，污染率显著下降，当以75%乙醇消毒20 s和0.1%HgCl2消毒11 min时，污染率变为0。但随着杀毒时间的延长，材料的死亡率大幅提高。综合考虑以上因素，认为0.1%HgCl2消毒9 min和75%乙醇消毒15 s为较理想的消毒处理时间，经过消毒处理，培养过程中褐化程度、污染率以及死亡率都较低，生长状态良好。

2.1.3 光照条件对山茱萸叶片形成愈伤组织的影响 在相同的培养基中，不同光照条件下的愈伤组织诱导率、愈伤组织的性状都有明显的差异。以山茱萸叶片为外植体，接种于诱导培养基中，将其中的一部分置于光照下（光照时间为12 h/d），而将另一部分放在黑暗中培养，接种外植体数均为30，接种第25天后其愈伤组织的生长情况如表3所示。

表3 光照条件对山茱萸叶片形成愈伤组织的影响

愈伤组织好的标准是生长快，颜色浅，愈伤疏松易生长，不易褐变。从表3可以看出，光照条件对山茱萸叶片愈伤组织形成的迟早、性状和出愈率等方面有很大的影响。据试验观察，暗培养下外植体黄化严重，叶片易褐变，愈伤组织生长速度慢，性状一般。在光照培养下的愈伤组织颜色为浅白色，生长快，高度分散，性状好。因此，光照培养更有利于山茱萸疏松愈伤组织的诱导。

2.2 山茱萸愈伤组织的继代培养

2.2.1 接种量对愈伤组织生长的影响 在其他条件不变的情况下，选择不同接种量的愈伤组织进行培养，根据培养后愈伤组织的生长率来确定最佳的接种量。当平均接种量分别为 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/瓶时，接种20 d后的平均重量分别为0.95、1.29、1.65、1.96、2.19 g/瓶，平均生长率分别为 58.3%、61.3%、65.0%、63.3%、56.4%。由此可见，接种量过大或过小都不利于愈伤组织的生长。当接种量为1.0 g/瓶时，愈伤组织平均生长率最高。接种量过大时，重量增加但生长率反而减少，这是由于部分细胞吸收不到营养，培养后期愈伤组织易老化褐变所致。因此，愈伤组织的适宜接种量在1.0 g/瓶左右。

2.2.2 不同pH值对愈伤组织继代生长的影响在其他培养条件相同的情况下，选择不同pH值的培养基进行继代培养，根据接种20 d后的重量来选择最适pH值。当pH值分别为5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，接种量为1.0 g/瓶，接种20 d后的重量分别为1.18、1.45、1.76、1.48、1.31 g/瓶。研究结果表明：初始pH值偏高或偏低都不利于愈伤组织的生长。当pH值小于5.6时，培养基无法很好的凝固，水分含量大，接入的愈伤组织生长缓慢，容易褐变死亡。当pH值大于6.0时，培养基较硬，接入的愈伤组织很难固定，容易松动，难以从培养基中吸收营养，这样也会造成愈伤组织生长缓慢，愈伤组织缺乏营养，颜色逐渐变黄，甚至褐变死亡。当pH值为5.6～6.0时，以pH 5.8为最佳，培养基软硬适中、质地良好，接种愈伤组织生长状态好，易得到疏松而生长旺盛的愈伤组织。

2.2.3 光照条件对愈伤组织生长状况的影响 以山茱萸叶片诱导产生的结构状态较为一致的疏松愈伤组织为材料，一组在12 h/d的光照条件下进行培养；另一组于25℃条件下进行暗培养。当接种天数分别为 1、5、10、15、20、25、30、35 d 时，光照条件下山茱萸愈伤组织的重量分别为0.60、0.64、0.73、0.85、0.95、1.02、1.06、1.03 g/瓶，暗培养条件下山茱萸愈伤组织的重量分别为 0.60、0.62、0.68、0.77、0.86、0.92、0.89、0.82 g/瓶。山茱萸愈伤组织在光照条件下，35 d后进入衰亡期，而在黑暗中30 d后就进入了衰亡期。观察细胞的状态后发现，光照下产生的愈伤组织随着培养时间的增加，细胞的颜色变化不大，生长状态也较好，而暗培养下的愈伤组织太疏松，时间稍长，褐变情况越来越严重。在光照条件下不同时间的生长量都要大于在黑暗条件下的生长量。由此可见，光照条件有利于愈伤组织的生长。

3 结论

研究分别选择了嫩叶、老叶、茎段、无菌苗作为外植体进行愈伤组织诱导，通过比较发现嫩叶、茎段、无菌苗都是较适宜的培养材料，其中以嫩叶、茎段为外植体诱导愈伤组织的形成，诱导率可达80%以上，愈伤形成的时间也相对较短；而以老叶为外植体，诱导率最差，只有40%左右，形成愈伤组织时择在光照强度1 500～2 000 lx，3%蔗糖，pH值为5.8左右时对嫩叶进行愈伤组织诱导，诱导效果最好。继代培养以pH值为5.8，接种量1g/瓶，在12 h/d的光照条件下进行培养，获得的愈伤组织最适宜做悬浮培养。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1998.

[2]赵世萍，付桂香.山茱萸化学成分和药理作用的研究进展[J].中草药，1997，28（3）：187.

[3]楚 晋，李 林.山茱萸化学成分及其药理活性的研究[J].中国自然医学杂志，1999，1（1）：46-48.

[4]王裕铭，杨 云，刘翠萍.山茱萸临床应用与药理作用[J].河南中医学刊，1999，14（1）：61-62.

[5]覃 艳，陈 宇.木薯组织培养快速繁殖的研究[J].广西农业科学，2007，38（1）：35-37.

[6]李 群，陈丽萍，石轶松.马蹄莲组培过程中真菌和细菌污染的消除方法研究 [J].四川师范大学学报（自然科学版），2001，24（6）：607-609.

[7]吕校石，杨建民.椴树组织培养中污染控制技术初步研究[J].河北林果研究，2004，（19）：1-5.