郝大勇，张 展，管一春，王兴玲，孙丽君，娄 华

郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052

人类辅助生殖技术在治疗不孕不育症的过程中取得了很大的进展，而卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)作为治疗男性严重少弱精症的主要措施，已经成为一项重要的辅助生殖技术。影响ICSI结局的因素中以卵子质量最为重要，第一极体出现是卵子核成熟的标志。作者通过对第一极体形态评价来判断卵子质量，了解不同取精方法对不同型别的第一极体卵母细胞经ICSI后受精、卵裂情况的影响。

1 材料与方法

1.1 卵子来源 2009年2月至8月在郑州大学第三附属医院生殖中心行ICSI助孕治疗的共110周期中，取处于第二次减数分裂中期(MⅡ)的卵母细胞1017枚，应用倒置显微镜(日本尼康TE-300)观察第一极体形态，分为4型[1]。Ⅰ型:圆形或椭圆形，形态完整并且表面光滑。Ⅱ型:圆形或椭圆形，形态完整，但表面粗糙。Ⅲ型:呈碎裂或多个。Ⅳ型:巨大型[2]。

1.2 精子来源 手淫取精738个、附睾穿刺/睾丸活检(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)/(testicular sperm aspiration，TESA)取精250 个、冷冻复苏精液29个。

1.3 卵子和精子准备 所有卵子取出后置于100 g/L人类血清白蛋白(美国SAGE公司)的HTF受精液中，于37℃、体积分数6%CO2条件下培养3～7 h，采用含80 kU/L的透明质酸酶(美国SAGE公司)消化卵母细胞周围的颗粒细胞，使用FlexipetTM剥卵针吸取吹打卵子数次，直至卵丘细胞完全脱落。剥好的卵子置于HTF受精液中培养0.5～1 h后行ICSI。精子准备:新鲜精液和冷冻精液均采用密度梯度离心法。附睾和睾丸精液采用粉碎后直接离心洗涤，取沉淀做微滴待用。

1.4 ICSI操作 将卵子和精子分别加入到盖有矿物油(美国SAGE公司)的微滴中，应用显微操作仪(德国 Eppendorf)，使用35度角 ICSI针(K-MPIP-1035，美国 COOK公司)在37℃恒温下选择活力好、形态正常的精子在聚乙烯吡咯炔酮中制动并在卵子液滴(美国HEPES公司)内行穿刺注射。注射之后的卵子放置在被覆矿物油的约25 μL卵裂液(美国SAGE公司)微滴中，37℃，体积分数6%CO2条件下培养。

1.5 评价指标

1.5.1 受精卵评价[1]ICSI后16～20 h观察卵子受精情况，无原核为未受精，双原核和双极体为正常受精，一个或多个原核为异常受精。

1.5.2 胚胎的评价[1]ICSI后68～72 h评价胚胎质量，并分为4级。Ⅰ级:细胞大小均匀，形状规则，透明带完整，胞质均清晰，无颗粒及多核现象，碎片＜5%(优质胚胎)。Ⅱ级:细胞大小略不均匀，形状略不规则，透明带完整，胞质可有颗粒，碎片6% ～20%(优质胚胎)。Ⅲ级:细胞大小明显不均匀，可有明显的形状不规则，胞质可有颗粒现象，碎片21% ～50%(可利用胚胎)。Ⅳ级:细胞大小严重不均，胞质可有严重颗粒现象，碎片＞50%(不可利用胚胎)。

1.5.3 评价指标[1]正常受精率=(正常受精卵子数/ICSI卵子数)×100%;卵裂率=(正常受精卵裂胚胎数/正常受精卵子数)×100%;优质胚胎率=(优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数)×100%。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0处理数据。不同取精方式4种类型第一极体卵母细胞经ICSI后正常受精率、卵裂率和优质胚胎率间的比较采用χ2检验和精确概率法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 手淫取精ICSI后正常受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 见表1。

表1 手淫取精ICSI后正常受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 %

2.2 PESA/TESA取精ICSI后正常受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 见表2。PESA/TESA取精患者所用卵母细胞无Ⅳ型第一级体。

表2 PESA/TESA取精ICSI后正常受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 %

2.3 冷冻复苏精液ICSI后正常受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 见表3。冷冻复苏精液患者所用的卵母细胞无Ⅱ和Ⅳ型第一极体。

表3 冷冻复苏精液ICSI后正常受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 %

3 讨论

有报道[2-5]称极体退变可导致纺锤体损害且分散，使染色体丢失，可能与卵母细胞老化有关。也有研究[1，6-7]证实卵母细胞第一极体形态与 ICSI胚胎质量和妊娠结局有关，认为极体形态可用来判断卵母细胞质量。当使用不成熟极体卵母细胞受精或在此阶段行ICSI，往往受精率较低，且常停滞在第一卵裂期[6]。卵母细胞第一极体形态影响ICSI受精率和胚胎质量，而胚胎发育速度不受其影响[8]。巨大型极体可使受精率、卵裂率、优质胚胎率下降，但是碎裂型胚胎并不影响ICSI结局[9]。Ⅰ型第一极体卵母细胞成熟程度高，妊娠率高[10]。

以往国内外的类似报道并未对卵子按精液来源的不同进行详细的分类分析，作者将1017枚人卵母细胞按精液来源的不同分为3种类型，排除了由于精子质量相差较大对ICSI后结局的干扰。男性每次手淫排射取出的精子，多数属于成熟期精子，并且有完整的结构(精子头、体、尾)。PESA/TESA取精主要是针对手淫排射取出的精液内没有精子，而进行附睾或睾丸内的创伤性取精。主要是由于睾丸生精功能障碍，无法产生大量精子，或是输精管梗阻造成精液不能排出体外而进行PESA/TESA取精。取出的精子均伴有不同程度的畸形、活动力低下等异常，精子质量较差。冷冻精液是指添加过冷冻保护剂的精液在一定冷冻降温程序后，最后放入液氮(－196℃)中超低温保存。虽然精子经过冷冻复苏后，仍然可以保持激活卵母细胞的能力，但冷冻解冻过程和冷冻保护剂的添加对精子质量有影响。该研究结果显示手淫取精组Ⅰ和Ⅱ型第一极体卵母细胞正常受精率高于Ⅲ、Ⅳ型，这与报道[9]有异。PESA/TESA取精组中Ⅰ型第一极体卵母细胞取卵后第3天优质胚胎率高于Ⅱ型，但受精率低于Ⅱ型。分析可能是由于PESA/TESA精子质量相差较大导致的，而卵子因素并不突出。冷冻复苏精液组第一极体与ICSI关系分析结果无明显差异可能与例数少有关。

综上所述，通过排除精子对ICSI受精的较大影响，正常受精和第一极体形态有关。第一极体形态分型在某种程度上可以判断卵母细胞质量，并且可以预测ICSI后的受精情况。

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