崔宏伟， 孙剑萍， 刘春燕， 文景芝＊

（1.东北农业大学农学院植物保护系，哈尔滨 150030；2.牡丹江烟草科学研究所，牡丹江 157011；3.黑龙江省农垦科研育种中心，哈尔滨 150090）

烟草野火病是由Pseudomonas syringae pv.tabaci（Wolf et Foster）Young，Dye et Wilkie引起的一种细菌性病害。20世纪80年代以来，该病在我国的主要烟区均大面积发生，并有逐年加重的趋势，造成了较严重的经济损失［1］。迄今为止，对该病的防治主要依靠农用链霉素，无论是在苗期还是大田都取得了较好的防治效果［2］。但由于十多年的连续使用，病原菌已经产生了抗药性，因此，提高烟草自身的抗病性对防治野火病具有重要意义。目前，对于烟草自身抗病性机理的研究，主要集中在抗病基因定位及分子标记辅助育种［3］，抗性基因的转化［4－6］和基因组 学［7－9］等 方 面，而 蛋 白 质 组 水 平 上 的研究在国内外还未见正式报道。烟草自身的抗病性与蛋白的表达与调控密切相关，因此从蛋白质组学角度分析烟草与野火病菌互作机理，揭示烟草的抗病机制，对烟草抗病性的合理利用和烟草野火病的可持续控制具有参考价值。本研究从蛋白质水平入手，研究抗病烟草品种接种野火病菌后差异表达的蛋白质，分析其功能，了解烟草在野火病菌胁迫下哪些蛋白质的表达发生了变化，为阐明烟草抗野火病的分子机制，发现和克隆重要抗病相关基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和菌种

抗野火病烟草品种‘K346’和烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）均由牡丹江烟草科学研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料种植、菌种扩繁和接种

将烟草种子温汤浸种后播撒在20cm×60cm育苗盘中，育苗盘中装满灭菌的混合营养土（营养土与蛭石1∶1混合），待植株长到5～6片叶时挑选长势一致的健康植株移栽至灭菌的混合营养土中，在人工气候室中培养，培养条件为28℃光照16h与25℃黑暗8h交替，光照强度为5 000lx。保持土壤湿润，每隔一周喷施一次烟草叶面肥（由牡丹江烟草科学研究所提供）。

将活化后的烟草野火病菌在PDA斜面上26℃下培养48h，无菌水洗下，配成细菌悬浮液。无菌水稀释成浓度为2×108cfu／mL，作为接种液备用。

采用多针针刺法接种［10］。在烟草植株10叶期，选择距地面第5、6、7片叶接种，每片叶接10个点，接种后喷水保湿24h。

1.2.2 样品的采集和蛋白质的提取及浓度测定

分别在接种后0、1、3、6、12、24、36、48h和72h时取样，以0h的样品为空白对照，每个处理3次重复。取样部位为接种点附近1cm处未发病的叶片组织。烟草叶片蛋白质的提取方法参照Darwent等的TCA／丙酮法［11］。蛋白浓度测定参考Bradford法［12］并略作改进。

1.2.3 第一向等点聚焦电泳（IEF）和第二向SDSPAGE电泳及染色

参照Ettan 2D系统用户手册与刘文文等［13］的操作方法进行。

1.2.4 凝胶图谱分析、质谱分析和生物信息学分析

利用ImageMasteTM2DPlatinum 6.0软件分析蛋白质表达谱。以对照处理为参考胶，使用软件的自动检测蛋白质点功能和匹配功能，并进行手动校正等分析后，选取不同处理间相对体积和强度差异至少大于2.5倍的蛋白点，挖取蛋白点置于0.5mL的EP管中，－80℃保存。将所得的差异蛋白质点送至上海生工蛋白部进行酶切和 MALDI－TOF－MS分析，获得蛋白质肽段质量数据，在http：∥www.matrixscience.com中检索，找到相匹配的蛋白，得到的信息在http：∥www.ncb.inlm.nih.gov／，http：∥www.expasy.ch／sport／或 http：∥predictome.bu.edu／等数据库中进行检索，找到各个蛋白所对应基因的定位及功能等相关信息。

2 结果与分析

2.1 烟草叶片蛋白质等电点范围的确定

首先采用pH 3～10的IPG胶条对烟草叶片蛋白质进行双向电泳，发现烟草叶片蛋白质在双向电泳图谱上分布较集中，大部分位于pH较小的一面。所以选择pH 4～7的IPG胶条再次进行双向电泳，得到了高清晰、分布好的双向电泳图谱，因此在后续试验中选用pH 4～7的IPG胶条。

2.2 烟草叶片受野火病菌侵染后的蛋白质差异表达

经蛋白质凝胶双向电泳结合ImageMasteTM2D Platinum 6.0软件分析，每块胶上分离得到800～1 000个蛋白点。对比对照样品的电泳图谱，比较野火病菌处理的各时间段处理组与同期对照组双向电泳图谱，在1、3h和6h的处理组上很难找到表达差异明显的蛋白质点；而在12、24、36h和48h的双向电泳图谱上找到了多个与对照组表达有显著差异的蛋白质点。并且处理12h的电泳图谱较处理24、36、48h的电泳图谱重复性好、表达量大且相对稳定。经软件分析，共选取处理12h的10个差异表达的蛋白质点。其中，6个减量表达，编号为C15～ C20；4个增量表达，编号为C21～C24（图1）。

图1 接菌组与对照组差异蛋白点表达图谱放大图

2.3 差异表达蛋白质的 MALDI－TOF－MS质谱分析与鉴定

将6个减量表达和4个增量表达的蛋白点，分别从对照和接菌处理叶片蛋白质2－DE凝胶上挖取下来，进行胶内酶切和 MALDI－TOF－MS质谱分析后分别得到10个差异蛋白质点的肽质量指纹图谱，在数据库中检索与之匹配的蛋白质，结果见表1。

表1 差异表达蛋白质的质谱鉴定和数据检索

增量表达的4个蛋白质分别为叶绿体景天庚酮糖－1，7－二磷酸酯酶、光捕获叶绿素a／b结合蛋白、谷氨酰胺合成酶GS58、高等植物光系统II氧复合物中Psbp A链蛋白；减量表达的6个蛋白质分别为ATP合成酶CF1α亚基、假定1，5－二磷酸核酮糖羧化酶小亚基前体、1，5－二磷酸核酮糖羧化酶链S、1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶大亚基、叶绿体ATP合成酶CF1α链、核酮糖单－1，5－氢钙羧／加氧酶大亚基。

3 结论与讨论

本研究以野火病菌侵染后的烟草抗病品种为研究对象，经蛋白质双向电泳和质谱分析，检测到10个蛋白质在接种后表达量发生明显变化，其中4个为增量表达，6个为减量表达。

3.1 呼吸作用相关蛋白

本研究分离得到的减量表达蛋白点C15为ATP合成酶CF1α亚基，C19为ATP合成酶CF1α链组成部分。ATP合成酶由F0（叶绿体中称CF0）和F1（叶绿体中称CF1）两部分组成，广泛存在于线粒体、叶绿体、原核藻、异养菌和光合细菌中，是参与能量代谢的关键酶［14］。叶绿体CF1是酶的膜外部分，由α、β、γ、δ和ε5种亚基组成［15－17］。

寄主－病原物互作原理认为，植物的主动抗病性在呼吸作用上的表现为：在病原菌侵染初期，植株光呼吸强度和暗呼吸强度明显降低，显症后则明显上升，产孢期达到高峰，发病末期甚至停止呼吸［18］。在本研究中，人工接种12h时，植株并没表现出明显感病症状，此时为病原菌的侵染初期，作为细胞内能量转换核心酶的ATPase（C15、C19）减量表达，表明烟草在被侵染初期电子传递和能量传递能力减弱，即在病原物侵染初期某些生理途径被病原菌破坏，或被病原菌产生的降解酶和毒素抑制从而降低植株呼吸作用强度，触发植物的主动抗病机制，这一表现与寄主－病原物互作机制原理相符，是植株主动防御机制起作用的必要过程。根据寄主－病原物作用机制原理，本研究认为ATP合成酶相关酶的减量表达，是植株抗病过程中的一个必要表现。

3.2 能量代谢相关蛋白

本研究分离到在接种病原菌以后表达量大幅度下降的4个差异蛋白点C16、C17、C18和C20，它们均为1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（RuBisCo）相关蛋白。Rubisco是由多个大亚基（LSU）和小亚基（SSU）组成的重要蛋白复合体［19］，大亚基具有催化功能，小亚基仅具有调节作用，是决定C3植物光合效率的关键酶，具有同时参与光合CO2固定及光呼吸 CO2释放的双重功能［20］。

很多研究证实，植株在接种病原菌后rubisco活性和含量均表现出下降趋势。如白粉菌侵染大麦［21］和小麦［22］叶片后，rubisco活性和数量均下降。rubisco是碳素循环中的重要酶类，其减量表达预示着植株体内碳素循环效率的降低和物质代谢能力的减弱。本研究中得到的减量表达蛋白点C16、C17、C18和C20与碳素循环直接相关，其表达量的减少表明烟草在受到病菌侵染后光合作用下降，同时部分蛋白开始降解，植株开始逐渐衰弱，进一步降低了对病原菌的抵抗能力，从而加速了植株的发病。

3.3 糖类和碳代谢相关蛋白

本研究分离到的蛋白点C21、C23和C24分别为高等植物光系统II氧复合物中Psbp A链蛋白、叶绿体景天庚酮糖－1，7－二磷酸酯酶（sedoheptulose－1，7－biphosphatase，SBPase）和光捕获叶绿素a／b结合蛋白，这些蛋白在接种病原菌后表达量显著增加。SBPase是碳循环与糖代谢的关键酶，与1，5－二磷酸核酮糖（ribulose－1，5－biphosphate，RUBP）的再生密切相关。据报道仅在叶绿体中发现了该酶，并且SBPase没有已知的胞质对应物，它的主要作用是将景天庚酮糖－1，7－二磷酸（SBP）去磷酸化，生成景天庚酮糖－7－磷酸和无机磷酸。该酶对SBP具有特异性，并受到其代谢产物甘油酸［23］以及果糖－2，6－二磷酸［24］的抑制［25］。Lefebvre等［26］将拟南芥的SBPase基因转入烟草中并过量表达，发现光合效率和生长量以及碳同化水平在转基因植物中明显增加。骆桂芬等［27］研究发现，可溶性糖合成量的增加可提高黄瓜抗霜霉病能力，此外，还观察到光系统II的量子效率降低，导致叶片中的糖类累积量降低。这表明在病原菌侵染的逆境下，叶绿体捕光量增加，提高光反应从而补充在呼吸作用减弱情况下未能及时提供给植物的能量，同时病植株中糖代谢的主要途径为磷酸戊糖途径，会产生大量的中间产物，这些中间产物是重要的生物合成原料，与核糖核酸、酚类物质、木质素、植物保护素等许多化合物的合成有关，有利于植株修复被病原菌侵染破坏的植物组织。

3.4 氨基酸代谢相关蛋白

谷氨酰胺合成酶GS58是植物氮素代谢中的重要酶，其主要功能就是促进游离的分子氨合成谷氨酰胺。本研究发现在接种病原菌后烟草叶片中谷氨酰胺合成酶含量明显增加，表明烟草植株的氮素循环增强，更多谷氨酸与游离分子氨在谷氨酸合成酶的作用下生成谷氨酰胺，并参与到植物氨基酸代谢途径中，这将有利于维持植物体内的正常代谢，从而提高植株的抗病性。戚元成［28］、刘卫群［29］通过打顶的方法使烟草叶片内谷氨酰胺合成酶表达量增加，发现烟草氮素代谢的效率得到了显著的提高，同时也发现由于氮素代谢的增加，烟草植株对逆境的抗性也随之增加。由此可推测，谷氨酰胺合成酶在增加烟草抗病性中起重要作用。

综上所述，在本研究中，接种野火病菌后烟草叶片中物质代谢与能量代谢相关蛋白减量表达，植株体内碳循环减弱和光合作用能力降低。本研究中检测到的减量表达蛋白点均为直接参与植株光合作用的蛋白，表明植物受病菌侵染后光合作用下降。ATP合成酶的减量表达表明某些生理途径被病原菌破坏，或被病原菌产生的降解酶和毒素抑制，从而使植株生理活性降低，进一步降低了抗病能力。糖是生物体内有机物代谢中心，糖类代谢相关蛋白表达量的增加，表明在病原菌胁迫下叶绿体捕捉并固定了更多光能，并且促进了RUBP的再生，加速了碳循环，从而合成了更多的糖类，提高了烟草的抗病能力。氨基酸代谢相关蛋白（C22）与植物的抗病性关系比较复杂，一方面，由氨基酸构成的蛋白质可作为信号分子刺激植物的自身防护机制；另一方面，由于氨基酸循环的增加，产生更多的氨基酸用于合成各种植物蛋白，能迅速修复被病原菌破坏的植物自身蛋白，从而提高植物的抗病性。烟草的抗性机制是十分复杂的，涉及大量基因的诱导表达与调控，这些基因的表达结果往往导致蛋白质水平的变化。本研究得到了烟草对野火病菌应答网络中表达量发生显著变化的10个差异蛋白，但并未对所得到的差异蛋白在应答机制中的具体作用进行阐述，而这些蛋白质的具体功能及其在应答网络中的位置和功能有待进一步的深入研究。

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