张荣武 （山东省陵县畜牧局 253500）

2011年12月，泰安市某蛋鸡厂饲养的60日龄的柴公鸡发生大批量死亡。病鸡精神沉郁，食欲废绝，羽毛松乱，翅膀下垂，呼吸困难，喷嚏，有呼吸啰音，鼻腔常有分泌物流出，怕冷扎堆。剖检发现病死鸡气囊浑浊，心包浑浊，气管环有出血，个别鸡支气管有干酪样栓塞，肝脏肿大，肾脏肿大有尿酸盐沉积，腺胃乳头肿大个别鸡腺胃乳头出血，十二指肠有点状出血，盲肠扁桃体肿大，法氏囊萎缩。该鸡场爆发的疾病疑似肾型传染性支气管炎，为进一步确诊进行实验室诊断。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 伊红美蓝培养基，麦康凯琼脂、生化试剂微量管(均购自杭州天和微生物试剂有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术公司)；ExTaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Trans2K DNA Marker购自北京全式金生物科技有限公司；IB、H9、ND病毒抗原购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 细菌分离及初步鉴定 用无菌接种环取病死鸡的肝脏、心脏，划线接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养18～24h，在麦康凯琼脂平板上挑取红色菌落接种于伊红美蓝平板，革兰氏染色，观察细菌形状和染色特性。

1.3 生化反应鉴定 将分离菌接种于蔗糖、水杨酸、D-木糖、硫化氢、卫矛醇、乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、间-肌醇、尿素酶、七叶苷水解、葡萄糖、山梨醇、吲哚、M-R、V-P、枸橼酸盐利用、明胶液化等19项生化试验。

1.4 分子生物学方法鉴定 根据GenBank上公布大肠杆菌的序列在其高度保守的区域分别设计一对引物用来鉴定大肠杆菌，上游5-atgcgacttgataaatttat-3，下游5-ttagacgacgctggcaatt-3。鉴别扩增体系如下：PCR扩增体系：10×buffer2.5μl；……