李博文，李明涛，柏会文，刘玉芬

(哈尔滨师范大学)

0 引言

甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)，是由肝细胞合成并分泌入血的一种天然免疫因子，属C型凝集素(Ca2+依赖型)超家族，被认为是非免疫宿主体内最重要的一线抗感染免疫分子［1］.MBL肽链有4个功能区域:一个富含半胱氨酸的N末端区、胶原样区(collagenlike region，CLR)、颈区和 C末端糖基识别域(carbohydrate-recognition domain，CRD).CRD是MBL的识别功能区，在Ca2+的参与下，CRD特异性地与多种细菌、病毒、恶性细胞表面具有的以甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、岩藻糖等糖类等为末端糖基的糖结构结合，通过CLR区而发挥效应［2］.牛MBL作为机体的一种天然免疫因子，在牛的天然防御过程中发挥着重要的作用，但是目前对于该因子结构的研究资料较少，本研究将对该分子的CRD区进行分析，为牛MBL-A的分子应用提供铺垫.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

新鲜牛肝脏组织

1.1.2 引物设计与合成

根据GenBank数据库中MBL-A的cDNA基因序列 (登录号:BC109674)，采用 Primer Premier 5软件设计一对特异引物，引物序列为正向引物5’-AGAAGCTGTATGTGACCAATCG-3’，反向引物5’-CAGAGCAGCAGGGAGACACT-3’，委托上海生工生物工程有限公司合成.

1.1.3 主要试剂与工具酶

AMV第一链cDNA合成试剂盒、UNIQ-10柱式胶回收试剂盒;TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、pMD18-T载体均购自上海生工生物工程有限公司.其它相关试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 肝脏总RNA的提取

取牛新鲜肝脏组织0.5 g，用液氮迅速研磨成粉末状，加入 700μL SDS缓冲液，350μL Tris酚，350 μL 氯仿，100 μL β -巯基乙醇，用漩涡振荡器剧烈震荡 10 min，14000 rpm、4℃离心10 min.取上清，加入等体积酚∕氯仿，剧烈震荡5 min，14000rpm、4 ℃离心5 min，重复一次.取上清，加入等体积氯仿(氯仿∶异戊醇=24∶1)，剧烈震荡5 min，14000 rpm、4℃离……