冀云肖，常 芸

一次性力竭运动后心肌核转录因子Kappa B的变化及其在运动性心肌微损伤发生中的作用

冀云肖，常 芸

目的：研究一次性力竭运动后大鼠心肌NF-κ B在基因与蛋白水平的分布及变化规律。方法：100只健康成年雄性SD大鼠，随机分为一次性力竭游泳运动组及安静对照组。应用RT-PCR和免疫荧光组化技术，从mRNA及蛋白水平研究大鼠心肌NF-κ Bp65的在力竭运动后不同时相的分布及表达变化。结果：对照组NF-κ B主要分布于细胞质、细胞膜及血管内膜，偶见于细胞核内，力竭运动后NF-κ B主要分布于细胞核、细胞膜和血管内膜。一次性力竭后6 h左心室NF-κ B p65蛋白含量显著高于对照组、12 h组、24 h组（P＜0.05）；运动后即刻室间隔NF-κ B p65蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05），非常显著高于12 h组、24 h（P＜0.01），运动后6 h非常显著高于12 h组（P＜0.01）；运动后即刻右心室NF-κ Bp65蛋白含量即显著高于安静对照组、24 h组（P＜0.05），运动后6 h组显著高于安静对照组（P＜0.05）。一次性力竭运动后即刻心肌总的NF-κ Bp65蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05），6 h组非常显著地高于对照组水平（P＜0.01），运动后12 h组显著低于即刻组和6 h组。一次性力竭即刻NF-κ Bp65mRNA含量显著高于一次性力竭24 h组（P＜0.05）；6 h显著高于对照组、24 h组（P＜0.05）；12 h显著高于24 h组（P＜0.05）。结论：一次力竭运动后不同时相心肌NF-κ BmRNA和蛋白表达增加，可介导一系列炎症反应对细胞造成损伤,构成运动性心肌微损伤中发生机制之一。一次力竭运动后心脏各部位改变存有一定差异，其中室间隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快,以室间隔NF-κ B蛋白峰值水平最高,且右心室NF-κ B蛋白改变恢复最慢。

力竭运动；核转录因子KappaB(NF-κ B)；心肌微损伤

研究表明，运动作为一种应激因素对人体有明显的的作用，适当的运动可以有效地改善心血管功能，使心脏产生一系列有益的适应性变化。而大强度运动特别是剧烈运动或力竭运动可造成心肌多方面的损害。运动性心肌微损伤及对人体的影响逐渐成为运动医学研究的热点问题之一，发生机制目前尚不完全清楚，其发生过程十分复杂，涉及心肌缺氧、心血管痉挛、氧自由基、血液黏度增加、MCP-1、低氧诱导因子等众多因素。

核转录因子kappaB（nuclear factor-kappa B, NF-κ B）是一种对缺氧敏感的炎症反应标志物，NF-κ B可与某些基因启动子（promotor）固定核苷酸序列结合从而启动基因转录。NF-κ B可调控细胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等）、细胞因子（IL-3、I L-6、TNF-α、IL-8等）、化学趋化因子（MCP-1等）、生长因子等多种基因的转录表达，参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡等多种生物进程[1]。研究已经证实NF-κ B在缺血再灌注心肌损伤中起着关键作用，在运动条件下心肌细胞中NF-κ B的改变还未见研究报道。本文通过检测大鼠力竭运动后心肌核转录因子κ B的分布和变化来探讨其在力竭运动所致的心肌微损伤中的作用，并为医务监督提供理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康纯种雄性SD大鼠100只(维通利华公司)，2月龄，体重（240±20） g，随机分为一次性力竭运动即刻组、6 h组、12 h组、24 h组及一次性力竭运动的安静对照组，每组10只。国家标准啮齿动物饲料喂养，自由饮食。饲养环境为室温（18±2）℃，光照12 h，相对湿度为40%～55%。

1.2 运动方案

依据经典的Thomas实验方案建立动物力竭运动致心肌微损伤模型。模型采用PVC特制泳池，规格为1.6 m×0.8 m× 1.2 m，内壁光滑，水深约60 cm，超过大鼠身长2倍，控制水温在30～33℃。运动组大鼠进入动物房后首先适应3 d，然后进行2d适应性游泳运动。力竭标准参照Thomas DP的报道[2]，即“大鼠连续沉入水中超过10 s，捞出后置于平面不能完成翻正反射”。

1.3 取材与样本制备

一次性力竭运动组分别于运动后即刻、6 h、12 h、24 h取材，安静对照组同期取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(1 ml/100 g体重)麻醉后，开胸后迅速取出心脏，经灭菌生理盐水清洗后，滤纸吸干并称重，然后尖锐刀片分离心室与心房，取一部分心室滴加OCT包埋剂后置于液氮冷冻20 s，以冠状面制作冰冻切片，切取7～8 μ m厚的冰冻切片置于-70℃超低温冰箱备用；另一部分迅速投入液氮中，后转入-70℃超低温冰箱待用。

1.4 心肌冰冻切片的免疫荧光染色

1.4.1 免疫荧光染色步骤

采用免疫荧光双标染色方法检测心肌中NF-κ B的分布及含量。主要试剂：兔抗大鼠NF-κ B p65多克隆抗体美国Santa Cruze公司产品；Dyl i ght标记山羊抗兔二抗美国Jackson公司产品；DAPI细胞核染液购于碧云天生物研究所；山羊血清购自北京中杉金桥公司。具体步骤如下：（1）从-70℃超低温冰箱取出保存的冰冻切片，室温复温30 min。（2）4℃丙酮固定10 min，PBS漂洗5 min×3次；（3）滴加1：10稀释的山羊血清，室温封闭15 min；（4）倾去血清，勿洗，滴加1：5 0稀释的兔抗大鼠NF-κ B p65多克隆抗体，4℃过夜；（5）取出玻片，倾去一抗，PBS漂洗5 min×3次滴加。（6）滴加1：100稀释的Dylight标记山羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h后PBS漂洗5 min×3次；(（7）滴加DAPI原液50 μ l/片，室温孵育6 min，PBS洗5 min×3次。（8）甘油封片。PBS代替一抗作阴性对照。

1.4.2 免疫荧光图像采集与分析

用Leica As MDW多维活细胞成像工作站采集荧光图，490 nm激发FITC，390 nm激发DAPI，图像放大200倍观察并采集荧光图像。每张切片左心室、室间隔、右心室3个部位各随机选取纵切心肌纤维3张图，横切3张图，每张切片取18张图。用LeicaQwin图像分析系统对其荧光强度进行定量，荧光强度用积分灰度代表，参考阴性对照标本中荧光强度，灰度值在4O～13O之间为蛋白阳性表达。

1.5 心肌RT-PC试验

1.5.1 心肌总R NA提取

采用硅基质吸附法提取心肌总R N A，按照天根生化RNAsimple提取试剂盒说明操作。取5 μ l总RNA加入95 μ l去DEPC水，在分光光度计上分别测定在260 nm和280 nm处的吸光度，计算A260/280的比值，以鉴定RNA的质量。

1.5.2 反转录

根据天根生化公司Quant Reverse Transcription第一链合成试剂盒说明进行操作建立反转录体系。操作步骤：将随机引物、10xRT缓冲液、dNTP混合液、RNA free ddH2O2在室温下解冻后迅速置于冰上，简短涡旋后简短离心收集残留在管壁的液体，配制20 μ l逆转录反应体系，将反应体系简短涡旋离心，37℃孵育60 min。

1.5.3 PC R扩增内参和目的条带

NF-κ B p65引物（150bp）：

上游：5`-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3`

下游：5`-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3`

GAPDH引物（284bp）：

上游：5`-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT -3`

下游：5`-TCTGAGTGGCAGTGATGG-3`

在PCR薄壁管中建立20 μ l扩增反应体系：Tap Master Mix 10 μ l，NF-κ B p65上下游引物各0.5 μ l，内参上下游引物各0.5 μ l，cDNA 1 μ l，ddH2O2 8 μ l总体积为20 μ l。反应条件为95℃预变性10 min；94℃变性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，10个循环，然后94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，20个循环；末次延伸72℃ 10 min。

取7 μ l产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。用Bio-rad凝胶成像仪拍摄电泳结果，并对内参照和目的基因条带做光密度扫描，通过二者的灰度比值来进行相对定量。

1.6 统计学处理

所有数据均用SPSS15.0软件包进行统计分析。组间进行单因素方差分析，结果均以平均数±标准差表示，其中P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著性差异。

2 结果

2.1 一次力竭运动后大鼠心脏各部位NF-κ B p65蛋白表达与分布变化

2.1.1 一次力竭运动后大鼠心脏NF-κB p65分布变化

如图1可见Dylight标记的NF-κ B p65蛋白呈绿色点状或条索状荧光，DAPI标记细胞核呈点状蓝色荧光。正常对照组大鼠心肌NF-κ B p65蛋白主要位于细胞质中，细胞膜、血管内膜亦有表达，偶见于细胞核内（图A）。一次力竭运动组后荧光斑的数量、面积和亮度与对照组相比均发生不同程度的变化，蛋白分布也发生了相应的变化（图B）。一次性力竭运动后NF-κ B p65蛋白主要表达于细胞核内，细胞膜及血管内膜荧光斑数量也增多，亮度增强。

2.1.2 一次力竭运动后大鼠心脏各部位NF-κB p65蛋白表达变化（见表1）

一次力竭运动后即刻大鼠左心室肌NF-κ B p65蛋白含量上升，至运动后6 h达到峰值，显著高于安静对照（P＜0.05），随后NF-κ B p65蛋白含量下降，至运动后12 h、24 h NF-κ B p65蛋白含量已降至略低于对照组水平，显著低于运动后6 h（P＜0.05）。

一次力竭运动后即刻大鼠室间隔肌NF-κ B p65蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05）；运动后6 h略有下降，至运动后12 h NF-κ B p65蛋白含量降至比对照组更低的水平，与运动后即刻、6 h组比具有非常显著性差异（P＜0.01）；运动后24 h NF-κ B p65蛋白含量略有回升，显著低于即刻组（P＜0.0 5）。

一次性力竭运动后即刻右心室NF-κ B p65显著高于对照组（P＜0.05）；运动后6 h有所下降，仍显著高于安静对照组（P＜0.05）；运动后12 h hNF-κ B p65蛋白含量继续下降；至运动后24 hNF-κ B p65蛋白含量降至略高于安静对照组的水平，显著低于运动后即刻组（P＜0.05）。2.2 一次力竭运动后大鼠心脏总NF-κ B p65mRNA及蛋白的表达变化

图2、表2显示，一次性力竭即刻组NF-κ B p65mRNA含量显著高于一次性力竭24 h组（P＜0.05）。一次性力竭6 h组NF-κ B p65mRNA含量显著高于对照组、24 h组（P＜0.05）。一次性力竭12 h组显著高于一次性力竭24 h组（P＜0.0 5）。

如表2显示，一次性力竭运动后即刻心肌总的NF-κ B p65蛋白显著高于安静对照组（P＜0.05），运动后6 hNF-κ B p65蛋白非常显著地高于对照组水平（P＜0.01），运动后12 h时NF-κ B p65含量显著低于即刻组和6 h组。

3 讨论

研究发现，大强度运动和急性力竭运动可对机体产生不利影响，常导致运动性疲劳与损伤的发生，尤其是运动性心肌微损伤[3-5]。运动性心肌微损伤表现为心肌结构和功能的双重损伤。大鼠力竭运动所致的心肌损伤与临床缺血再灌注损伤存在较高的相似性，在力竭运动中由于心肌缺血可致心肌产生一定的损伤，而在运动后由于血液供应的恢复，可致心肌产生比运动时更严重的损伤。有研究发现力竭运动所致的心肌损伤不仅发生在运动后即刻，而且在运动后3～24 h更为严重，即存在逐渐加重的特点[3]。还有研究发现，力竭运动引起的心肌损伤在6 h的时相较严重，24 h后有所减轻，这些特点与临床上的缺血再灌注损伤具有高度相似性[6]。因此我们称之为运动性缺血再灌注损伤[7]。因为运动性缺血再灌注损伤主要发生在运动后24 h以内，因此我们选用0、6 h、12 h、24 h几个时相点研究NF-κ B在心肌微损伤中的作用。

表1 一次力竭运动后各时相大鼠左心室、室间隔、右心室积分灰度值TableⅠ Integral Grey Values of Rat Left Ventricle, Ventricular Septum and Right Ventricle at the Different Phases after One-time Exhaustive Exercise

表2 一次力竭运动后大鼠心脏总的NF-κ B p65mRNA及蛋白的表达变化TableⅡ Changes of the Total NF-κ B p65mRNA and Protein Expression of Rat Heart after One-time Exhaustive Exercise

NF-κ B p可与某些基因启动子（promotor）固定核苷酸序列结合从而启动基因转录。NF-κ B可调控细胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等)、细胞因子（IL-3、IL-6、TNF-α、IL-8等）、化学趋化因子（MCP-1等）、生长因子等多种基因的转录表达，参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡等多种生物进程[1]。在静息细胞，NF-κ B与其抑制性蛋白I κ B结合，形成三聚体复合物以非激活的形式存在于胞浆中。在受到刺激后，I κ B降解，NF-κ B被释放并转移到细胞核，结合到靶基因的启动子或增强子的κ B结构域，使靶基因转录增强。体内NF-κ B的调控包括：（1）正反馈：NF-κ B活化可增强TNF-α、IL-1 β等的表达，这些物质可再次激活NF-κ B，使炎症信号放大。（2）负反馈途径：NF-κ B的抑制蛋白也受其调控，NF-κ B活化后，其抑制蛋白的基因转录亦被上调，抑制蛋白增多可避免NF-κ B激活效应无限放大，终止炎症介质的生成。

本研究发现大鼠一次性力竭运动后大鼠心肌NF-κ BmRNA及蛋白含量均表现为先上升后下降的走势，与运动性缺血再灌注损伤规律相一致。研究证实，机械刺激、缺氧、自由基、细胞因子等均可激活NF-κ B，但是自由基是NF-κ B最强的激活因素，细胞内自由基水平调控着NF-κ B的激活[8]。Prosenjit Sen等证明氧化应激使NF-κ B的转录明显增加[9]。大鼠力竭运动自由基含量升高，自由基清除酶活性降低[10,3]。大量生成的自由基包括非脂质氧自由基和脂质氧自由基，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等使NF-κ B在缺血阶段激活的基础上被进一步激活，使NF-κ BmRNA及蛋白含量均呈上升趋势，随后由于负反馈逐渐增强，对NF-κ B抑制增强，使NF-κ BmRNA及蛋白均下降。NF-κ B含量升高，调控粘附分子（P-，E-，L-选择素等）、细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等）含量升高，中性粒细胞在粘附分子的协助下可发生迁移粘附，并可释放自由基及2 0多种蛋白水解酶，产生广泛的损伤作用，同时粘附的中性粒细胞变形能力变差，造成毛细血管的机械阻塞，导致微循环障碍，产生无复流现象，致使细胞发生不可逆性损伤和坏死，即再灌流性心肌损伤[11]。除中性粒细胞造成的损伤外，产生的多种细胞因子亦可分别或联合产生损伤作用，如：TNF-α可以通过多种途径影响心肌功能并造成心肌损伤,如抑制心肌收缩功能、诱导心肌细胞凋亡、刺激线粒体产生活性氧、促使PMN的粘附、浸润、活化；复血后中性粒细胞的心肌浸润显著增加，与TNF-α之间有良好的正相关性，抑制TNF-α可减少中性粒细胞浸润减轻心肌损伤[12]；IL-1 β的大量表达亦可表现除细胞毒性。NF-κ B还可通过调节细胞凋亡对细胞造成损伤。NF-κ B可调控bcl-2、Fas、cmyc、p53、HSP和Caspase等，具有调节细胞凋亡功能的蛋白家族酶类的表达[13]，使促凋亡酶与抗凋亡酶的平衡向促凋亡方向发展，促进细胞凋亡的发生。常芸等在研究中发现大鼠力竭运动后心肌凋亡明显增加，促凋亡基因表达增多[5]。运动后复氧阶段大量产生的自由基，也可以直接对细胞造成损伤。自由基可攻击细胞脂质膜，造成细胞膜和线粒体膜功能障碍，细胞内钠钙离子失调，造成线粒体钙超载，能量生成受阻，细胞肿胀，膜电位不稳，心率失常；自由基还可直接攻击核酸，引起DNA断裂、染色体畸变，激活血小板环化酶，生成大量血栓素A2、促进组织因子生成释放等从而导致心肌顿抑、血管内皮细胞功能障碍、心肌能量代谢障碍甚至引起肌原纤维破坏、线粒体损伤等超微结构的改变。这些损伤性改变可进一步刺激损伤性因素的增加，对心肌产生显著的损伤作用。在临床缺血再灌注研究中有较多的试验证实，抑制NF-κ B可减少缺血再灌注后细胞因子、粘附分子的表达，中性粒细胞的浸润等损伤性因素的出现，减轻心肌损伤程度。

对大鼠心肌不同部位NF-κ B蛋白含量的比较发现，大鼠力竭运动后室间隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快，室间隔NF-κ B蛋白峰值水平最高，右心室NF-κ B蛋白消退最慢，但不同时相各部位无显著性差异。推测室间隔及右心室较左心室易受损，这一推测与以往研究一致[14]。

4 结论

4.1 一次力竭运动后心肌NF-κ BmRNA和蛋白表达增加，可介导的一系列炎症反应对细胞造成损伤是构成运动性心肌微损伤中发生机制之一。

4.2 一次力竭运动后心脏各部位改变存有一定差异，其中室间隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快，以室间隔NF-κ B蛋白峰值水平最高，且右心室NF-κ B蛋白改变恢复最慢。

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(责任编辑：何聪)

Changes of Myocardial Nuclear Transcription Factor Kappa B and It's Role in Athletic Myocardial Micro-damage after One-time Exhaustive Exercise

JI Yun-xiao, CHANG Yun
(China Institute of Sport Science, Beijing 100061, China)

Objective To study the distribution and variation laws of rat heart muscle NF-κ B in gene and protein level after one-time exhaustive exercise. Method 100 healthy adult male SD rats were divided randomly into one-time exhaustive swimming group and control group. RT-PCR and immunofluorescence technology were adopted to study distribution and expression variations of rat heart muscle NF-κ B p65 at the different phases after exhaustive exercise from mRNA and protein level. Result In control group, NF-κ B mainly distributed in cell plasma, cell membrane and tunic intima, sometimes in cell nucleus. After exhaustive exercise, NF-κ B mainly distributed in cell plasma, cell membrane and tunic intima and cell nucleus. 6 hours after exhaustive exercise, NF-κ B p65 protein level of left ventricle is obviously higher than those of the control group, 12h group and 24h group (P<0.05). The NF-κ B p65 protein level of ventricular septum immediately after the exercise was significantly higher than that of the control group (P<0.05) and was much higher than the 12h group and 24h group (P<0.01). It was much higher than that of the 12h group 6 hours after the exercise. NF-κ B p65 protein level of the right ventricle was distinctly higher than those of the control group and 24h group (P<0.05) and this level of the 6h group was evidently higher than that of the control group (P<0.05). The total NF-κ B p65 protein level of heart muscle immediately after the one-time exhaustive exercise was significantly higher than that of the control group (P<0.05). This level of the 6h group was much higher than that of the control group (P<0.05). And the level of the 12h group was evidently lower than those of the immediate group and 6h group. NF-κ B p65mRNA level immediately after the one-time exhaustive exercise was clearly higher than that of the 24h group in one-time exhaustive exercise (P <0.05). The level of the 6h group was obviously higher than those of the control group and 24h group (P<0.05). The level of the 12h group was significantly higher than that of the 24h group (P<0.05). Conclusion The increase of heart muscle NF-κ BmRNA and protein expression at the different phases after the one-time exhaustive exercise may lead to a series of inflammatory reaction that can damage the cells. This is one of the occurrence mechanisms of athletic myocardial micro-damage. There is a difference in the changes of the different parts of heart after one-time exhaustive exercise. NF-κ B protein levels of ventricular septum and right ventricle rise quickly. NF-κ B protein level of the ventricular septum reaches the highest and the recovery of right ventricle NF-κ B protein changes is the lowest.

sports, power; constitution; science & technology; public service system; culture

G804.5

A

1006-1207(2012)04-0025-05

2012-06-27

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务经费（10-01）

冀云肖，男，研究生. 主要研究方向：运动心脏病理与医学监督.

国家体育总局体育科学研究所，北京体育馆路11号，北京100061