朱晓娜，曹伟伟，李明静，2*

1河南大学化学化工学院;2河南省天然药物与免疫重点实验室，开封 475004

槐花(Sophora japonica)又名槐蕊，为豆科植物槐的干燥花朵及花蕾，其中主要的黄酮类化合物是芦丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)［1］。研究表明，芦丁具有抗心肌缺氧、缺血、抗心律失常、降低血清胆固醇、抑制血小板集聚、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗辐射、抗病毒和增强免疫力等功能［2］。槲皮素除了有抗肿瘤、抗血小板聚集和抗氧化的作用外，还具有保护糖尿病的肾脏、肠粘膜、抗忧郁、抗心胸肥大、降压等作用［3］。分离制备槐花总黄酮中的活性成分为进一步研究黄酮类化合物药效作用机制和开发新的天然药物具有重要的意义。

目前，槐花的提取分离主要采用重结晶法和柱色谱法，分离周期长，消耗溶剂多，操作复杂。高速逆流色谱(High speed counter-current chromatography，HSCCC)作为一种新型分离纯化技术，采取液—液分配体系，克服了由固相载体带来的样品损失、失活、变性等缺点，操作方便，已被广泛应用于天然产物活性成分的分离纯化［4，5］。许有威［6］等用以乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3，v/v)为溶剂系统，建立了高速逆流色谱分离槐花中芦丁的方法。此方法简便，但是耗时较长。离子液体［7］，是一种在室温下完全由离子组成的有机液体物质，作为一种环境友好的溶剂，可取代挥发性溶剂，被广泛应用于电化学、有机合成、生物化学以及分离等领域［8］。但离子液体应用于逆流色谱的报道很少。本文采用超声提取从槐花中得到粗提物，再经HSCCC进一步分离得到芦丁和槲皮素(纯度都高于97%)。同时以离子液体作为高速逆流色谱流动相添加剂，缩短了出峰时间，提高了分离度，达到理想的分离效果，为槐花黄酮的进一步开发利用提高了一种快速实用的新方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TBE-300A型高速逆流色谱仪(中国上海同田生化技术有限公司);AKTA purifier泵及紫外检测系统(美国GE公司);Agilent 1100 HPLC仪(美国Agilent公司);超声波清洗器(上海现科仪器有限公司);DZF-6000型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);冷冻干燥机(Martin Christ Alphal-2，German)。

1.2 试剂

氯仿、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、冰醋酸等均为分析纯，高效液相色谱所用的甲醇为色谱纯，均为天津市四友精细化学品有限公司;水为二次蒸馏水;［BMIM］［PF6］:1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸购于上海成捷化学有限公司。

1.3 材料

槐花购于开封市中医院，40℃烘干，粉碎，用60%乙醇溶液，料液比1∶15(g/v)超声提取30 min，提取3次，合并滤液，减压浓缩至醇干［9］，放置沉淀24 h，离心沉淀，冷冻干燥，得槐花总黄酮粗提物(总黄酮纯度约为60%)。

2 实验方法

2.1 溶剂体系及样品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)两相溶剂体系，充分震摇后在室温下静置12 h。使用前将上相和下相分离，超声脱气30 min，冷却、待用。称取50 mg槐花总黄酮粗提物，用溶剂体系的上下相各4 mL超声溶解，备用。

2.2 高速逆流色谱法分离制备

开启恒温循环器，设定温度为25℃。以10 mL/min的流速将上相泵入主机，当固定相充满主机管道后，改用2 mL/min的流速泵入下相，同时启动主机，设置转速为800 rpm。待流动相流出约20 mL后，说明体系已达平衡。开启AKTA purifier检测系统，设置检测波长，待基线稳定后，将样品溶液注入主机。流出物在256 nm波长下进行检测，记录色谱图，收集目标成分，经真空干燥箱干燥后，称重，然后经高效液相鉴定纯度。

2.3 高效液相色谱分析条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB C18(150 mm ×2.1 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶0.02%-磷酸水溶液(50∶50，v/v);检测波长为255 nm;柱温为30℃;进样量为 15 μL;流速为 0.03 mL/min。

3 结果与讨论

3.1 溶剂体系选择

溶剂体系的选择在高速逆流色谱分离中至关重要。根据色谱理论，利用高速逆流色谱进行样品分离时，样品在互不相溶的两相中的分配系数在0.5-2之间，两相溶剂体系分层时间小于30 s［10］。本文采用TLC、HPLC测定。

3.1.1 薄层色谱法(TLC)

选取乙酸乙酯∶氯仿∶甲醇∶水;氯仿∶甲醇∶水;正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水;正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水四个体系。分别配制不同比例的上述四个体系，取上下相各5 mL，加入5 mg槐花总黄酮粗提物，超声溶解后转移至分液漏斗中，静置分层，取等量的上、下相薄层展开，根据展开剂乙酸乙酯∶水∶冰醋酸(8∶1∶1，v/v)展开后，斑点的位置、大小、颜色的深浅粗略判断目标产物在上、下相中的分配情况。

TLC结果表明:溶剂体系为氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)时，目标化合物在溶剂体系的上下相中溶解程度相近。通过薄层色谱对溶剂体系的初步筛选确定氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)为分离体系。

3.1.2 高效液相色谱法(HPLC)

称取5 mg槐花黄酮粗提物溶于事先平衡好的两相溶剂(上、下相各5 mL)，超声使样品充分溶解，静置平衡，取上下相各3 mL，蒸干，用色谱级甲醇溶解，经HPLC检测，并计算出各目标化合物的分配系数(K=Aupper/Alower，A为目标峰面积)，结果见表1。

由表1可知，样品在正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)溶剂体系中的分配系数在0.5 ～2 范围内，通过HSCCC预分离后，化合物之间可以分离，但分离时间过长。通过实验发现，在正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)体系中加入一定比例的冰醋酸和离子液体，可以改善分离效果。当利用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)体系，并加入1‰的1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸(［BMIM］［PF6］)分离时，化合物分离效果较好，分离时间适中。这可能是由于所分离黄酮类化合物分子结构中含有酚羟基，在体系中加入少量的酸，让目标样品不电离增加有机性，从而可以改善分离效果［11］。离子液体可吸附在固定相表面，可抑制流动相的分配，从而完善峰形［12］。因此，确定正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)为最终使用体系，并在1000 mL上述溶剂体系中，加入1 mL［BMIM］［PF6］为流动相添加剂。

表1 2种黄酮类化合物在三种溶剂体系中的分配系数(K)Table 1 The K(Partition coefficients)values of 2 flavones in three solvent systems

3.2 高速逆流分离制备的结果

按2.2操作方法经高速逆流色谱从槐花粗提物中分离制备得到3个流分(见图1和图2中 a、b、c)。结果显示，从50 mg槐花总黄酮粗提物中一次分离得到流分 a(18.2 mg)、流分 b(9.6 mg)、流分c(5.4 mg)。

图1 不加离子液体、(B)加入［BMIM］［PF6］槐花粗提物高速逆流色谱图Fig.1 HSCCC chromatograms of crude extract of Sophora japonica without ionic liquid(A)and with［BMIM］［PF6］(B)

由图1(A＆B)可以看出，在两相溶剂体系中，加入1‰离子液体［BMIM］［PF6］，分离效果得到明显改善。出峰时间由85 min提前为55 min，分离度由0.9提高到1.8，已经达到完全分离。其作用机理可能是:咪唑类阳离子和目标化合物之间的H键起着重要作用;PF-6的电负性使得化合物出峰时间缩短;部分离子液体附着与固定相表面，抑制其他成分在流动相的分配，完善峰形［13］。

图2 (A)槐花黄酮粗提物、(B)纯化出的化合物a(芦丁)、(C)纯化出的化合物b(槲皮素)、(D)未知混合物峰的高效液相图Fig.2 HPLC chromatograms of(A)crude extract of Sophora japonica，(B)Rutin，(C)Quercetin and(D)Impurities

3.3 纯度分析

采用2.3的条件对高速逆流色谱所得到的流分a、b、c进行HPLC检测分析，结果显示峰a和b分别是芦丁和槲皮素，经峰面积归一化法计算可知纯度均大于97%，峰c为未知成分混合峰。结果如图2所示。

4 结论

本文应用高速逆流色谱法首次从槐花粗提物中一步分离制备了芦丁、槲皮素两种黄酮类化合物，均达到较好的分离和纯化效果，利用HSCCC分离植物粗提物中的活性成分，可一步得到一种或几种单体，此方法操作简便、快速，有其他分离手段不可替代的优点。并首次把离子液体作为高速逆流色谱流动相添加剂，探讨了其对槐花中芦丁和槲皮素分离效果的影响，为其他黄酮类化合物的分离提供了有益的参考，进一步拓展了离子液体在色谱中的应用。

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