孙丽萍 彭定利 译

1 引言

牧豆树是干旱地带的一种十分重要的植物，它不但能在干旱季节表现出超强固氮能力，而且还是许多动物的庇护所和食物来源，这些动物以牧豆树的花蜜、花粉、树叶以及水果为食。牧豆树是四、五月份墨西哥杜兰戈州干旱、半干旱地带蜜蜂的唯一花蜜和花粉来源。当地蜂农在这一时期收获的蜂蜜风味一致，均为牧豆树蜂蜜，同样这两个月蜜蜂采集的花粉为纯牧豆树花粉。

牧豆树是具有生物学特性的天然产品的一个重要来源。对牧豆树花粉乙醇提取物体外抗氧化力的评价表明，该花粉具有较强的自由基清除能力，自由基清除力与其酚类物质的组成有关。花粉中的酚类化合物主要包括黄酮苷和羟基肉桂酸，不同种类花粉的酚类化合物的组成有所不同，并与花粉的药理特性（抑菌、抗肿瘤、止泻、抗氧化）有一定的关系。

众所周知，化学抗氧化性或体外生物抗氧化性的评价并不能代表真正的体内活动。本文的目的在于通过体外实验和体内实验研究牧豆树蜂花粉酚类物质组成与其抗氧化能力的关系，即在体外体系中将牧豆树蜂花粉酚类提取物作为小鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制剂；在体内体系（即溴苯诱导的小鼠肝损伤模型肝匀浆）运用硫代巴比妥酸法（TBARS）对抗氧化能力进行定量分析。同时对体内和体外两种系统下得到的结果进行比较。

2 材料与方法

2.1 花粉样品

实验所用的三种牧豆树蜂花粉由当地养蜂人专供。这些样品可作为2002年4月墨西哥杜兰戈州圣胡安德尔里奥采集到的蜂花粉的代表。从牧豆树花药采得的花粉取自蜂房周围的牧豆树。凭证标本保存在CIIDIR的植物标本室，并经植物标本室的植物学家Socorro Gonzalez鉴定。

2.2 显微镜检测

采用显微镜分别检测15份蜂花粉样品的花粉颗粒以及5份采自花药的花粉样品的花粉颗粒，以确定花粉植物来源和均一性。花粉样品都预先经乙酸水解。实验使用Olympus BX 40显微镜。

2.3 HPLC/DAD分析

采用高效液相色谱（二极管阵列检测器）直接比较蜂花粉和采自花药的花粉的酚类物质分布情况，确定黄酮醇或酚酸的组成以及其植物来源，这一方法已有人提出过，蜂花粉用含水乙醇（50%，v/v，1 ml）超声提取60 min，得到的浑浊液离心10 min，取上层清液做HPLC/DAD分析。采用Gylson 305 HPLC系统进行分析，进样量 20 μl，Gylson 170 紫外检测器；Waters Spherisorb S50D52（5 μm）色谱柱；乙腈-水体系（含酸）梯度洗脱；340 nm绘制谱图。220～400 nm范围内用DAD检测所有峰的光谱数据，采自花药的花粉样品按相同方法进行分析。根据Campos and Markham（2006）的方法进行结构识别。

2.4 提取

按照2.2确定花粉粒的均一性以后，按2.3进行提取并检测蜂花粉的酚类组成及植物来源。20 g花粉加入200 ml 50%含水乙醇（v/v）超声提取5次，每次60 min，提取液离心10 min。合并所有上清液减压蒸发至干即得到总提物。总提物用10 ml 50%含水乙醇溶解，等分分装，分别用于黄酮醇含量的检测及抗氧化能力评估。

2.5 总提物中黄酮醇含量的确定

分别在不同浓度标品和样品中添加氯化铝，在425 nm波长下对每个试样进行三次吸光值的测定，以样品浓度（μl/ml）或标品浓度（μg/ml）对吸光值作图进行线性回归，通过对槲皮素标准曲线进行线性回归分析来确定黄酮醇的含量，在1～50 μg/ml范围内槲皮素标准溶液的浓度与吸光值（425 nm）呈良好的线性关系，线性回归方程为 Abs425nm=-0.00221+0.054899（槲皮素），相关系数r=0.9973；在1～400 μl/ml（溶于50%乙醇）范围内样品浓度与吸光值线性回归的相关系数r为0.9989。花粉中含有较多黄酮醇，其含量以μg槲皮素/ml为单位。添加氯化铝后，黄酮醇产生包括邻位二羟基在内的波长红移，代表标准过程的重现。

2.6 对小鼠肝微粒体脂质过氧化作用的抑制作用

采用硫代巴比妥酸法（TBARS）定量分析样品对小鼠微粒体脂质过氧化的抑制作用，分析方法在Ohk awa等（1979）和 Uchiy ama，Mihara（1978）的基础上进行了改进。硫代巴比妥酸反应物的生成量反映了丙二醛（MDA）的含量（μg/L）。

选取CFI小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏用冷生理盐水漂洗后添加1.15%的冷KCl研磨得到浓度为10%的肝匀浆。微粒体制备参照Diczfalusy等（1996）的方法。微粒体蛋白分析采用Lowry的方法。反应体系如下：100 μl微粒体上清液（86 μg 蛋白质/ml）、待测样品的不同等分试样（0～100 μl）、50μl FeSO4和抗坏血酸的混合水溶液（含FeSO46.95 mg，抗坏血酸17.62 mg）、添加Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 7.4）至 500 μl，置具塞试管内于37℃下孵育30 min，水冷却，每管中加入3 ml 1%的磷酸和1 ml 0.6%的硫代巴比妥酸，沸水浴加热45 min，冷却后，加入4 ml正丁醇充分混匀，离心10 min分离醇相，然后在535 nm和520 nm波长下测定其吸光值，根据MDA在两个波长下测得的吸光的差异来评价硫代巴比妥酸反应物的浓度，选取4个浓度对参照物（槲皮素、槲皮苷和咖啡酸）进行测定。脂质过氧化反应抑制能力的大小以IC50值衡量（即抑制半数MDA生成所需要的抗氧化剂浓度，单位 μg/ml），IC50值通过MDA浓度与样品黄酮醇浓度的线性回归曲线来计算。每个待测物的等分试样分别做三个平行分析。

2.7 抑制溴苯诱导小鼠模型的脂质过氧化反应

诱导小鼠中毒参照Zhang和Shen（1997）的方法。80只雄性CFI小鼠（墨西哥Nacional de Virologia研究中心）随机分成8组：一组作为实验对照组用食用油喂食；一组用200 μl牧豆树蜂花粉提取物喂食（黄酮醇浓度 C1=9.794 μg/ml）；一组用 200 μl牧豆树蜂花粉提取物喂食（黄酮醇浓度 C2=21.751 μg/ml）；一组用 200 μl维生素E喂食（400UI）；一组以溴苯（200 μl，溴苯94.211 μg/ml食用油）诱导中毒；另外三组分别用维生素E（400UI）、C1或C2浓度的蜂花粉提取物喂食后再用溴苯致毒（200μl，溴苯94.211μg/ml食用油）。小鼠饥饿一宿后喂食抗氧化剂，30～60 min后溴苯致毒。

19～22 h后小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠的整个肝脏分别用冷生理盐水漂洗，用1.15%的KCl匀浆制成10%的匀浆液。取500 μl的匀浆液采用硫代巴比妥酸法（TBARS）进行分析，方法参照2.6。用维生素E作为对照，以确定蜂花粉提取物的相对抗氧化率。每个匀浆液样品做三组平行分析。

2.8 数据分析

数据采用方差分析法分析（P≤0.05），均值经邓肯多重比较检验分析，结果由CASTAT计算机程序处理。

3 .结果和讨论

3.1 显微镜检测

显微镜检测显示蜂花粉粒在较大的程度上表现出均一性状，这一结果肯定了Campos等（1997）和Almaraz-Abarca等（2004）的研究结果，即组成花粉的花粉粒大都来自同一品种。蜂花粉的花粉粒以及采自花药的花粉粒的镜检直接比较结果显示蜂花粉均来自牧豆树。

3.2 HPLC/DAD分析结果

有文献报道可通过直接比较蜂花粉与花药花粉的酚类物质HPLC/DAD分布情况来确认蜂花粉的植物来源。本文研究发现，蜂花粉的酚类物质分布与采自牧豆树花药花粉的酚类物质分布是一致的。在本实验所采用的液相分析条件下，只检测到了黄酮类化合物和肉桂酸衍生物。

表1牧豆树花粉中的酚类成分（与墨西哥杜兰戈州采集的牧豆树蜂花粉中酚类成分一致）

牧豆树花粉中含有黄酮苷，特别是芹菜素、槲皮素和异鼠李素的衍生物，还可能含有木犀草素和染料木黄酮，这些化合物都具有广谱的生物活性。

3.3 体外实验：预防肝微粒体脂质过氧化反应

实验根据牧豆树蜂花粉乙醇提取物在硫代巴比妥酸实验中对微粒体系统脂质过氧化反应的抑制能力来评价其抗氧化能力。测得的提取物及参照物（槲皮素、槲皮苷和咖啡酸）的IC50值见表2。

表2牧豆树蜂花粉乙醇提取物及参照物的IC50值

在该实验条件下，蜂花粉提取物有效的抑制了脂质过氧化反应，其抗氧化能力高于参照物，甚至高于槲皮素的抗氧化力。Terao（1999）和 Okuda（1999）的实验证明槲皮素是一种对抗脂质过氧化的有效抗氧化剂。

每个种属特有的黄酮和酚酸的组成及含量对确定不同种属来源花粉的抗氧化能力有决定性的作用。有酚羟基的化合物在体外表现出很好的抗氧化能力，在B环的3'和4'位置上有二羟基结构的黄酮类化合物抗氧化能力尤为突出。牧豆树花粉中的木犀草素和槲皮素衍生物是具有该结构的黄酮类化合物。将牧豆树蜂花粉与绿穗苋花粉、混合蜂花粉（由墨西哥杜兰戈州的六种单一品种花粉混合而成）比较，在基本相同的实验条件下它们在体外生物系统中的脂质抗氧化能力不相上下，而这些花粉中黄酮类化合物的组成各不相同。可见，不同种属来源以及不同黄酮组成的花粉也可能表现出类似的抗氧化能力。牧豆树花粉、绿穗苋花粉和混合蜂花粉的抗氧化力均高于以下植物花粉：Rannunculus petiolaris（IC50=0.52 μg/ml）、万寿菊（IC50=2.6 μg/ml）、Bidens odorata（IC50=3.6 μg/ml）、Solanum rostratum（IC50=5.9 μg/ml）和 Zea mays（IC50=16.2 μg/ml），而根据Almaraz-Abarca et al.（2004）报道的 IC50值，这些植物花粉的抗氧化力在蜂产品领域均极具代表性。

3.4 体内实验：预防溴苯诱导的小鼠肝损伤

在本研究中，我们通过测定硫代巴比妥酸反应物的含量来衡量溴苯诱导致毒小鼠的肝损伤程度；在小鼠致毒前以牧豆树花粉黄酮醇提取物喂食，评价两个不同浓度提取物对溴苯诱导致毒小鼠的保护作用。结果见表3。

黄酮醇浓度为 C2（21.751 μg/ml）的总提物由于其自身的氧化性，使得它与实验浓度的溴苯一样对小鼠的肝脏具有致毒作用，分别产生了浓度为0.225 μg/ml和0.202 μg/ml的MDA，而以总黄酮浓度为C1（9.794 μg/ml）的总提物喂食的实验组小鼠产生的MDA值（0.0107 μg/ml）低于实验对照组。这两个实验结果表明，在未诱导氧化应激时，高浓度的牧豆树花粉黄酮醇提取物对机体有害，因为它自身就是能一种能诱导肝损伤以及产生大量MDA的氧化剂。已有文献报道多酚在某些特殊条件下对氧化反应有促进作用，如给以瞬间高浓度金属离子的刺激能诱使多酚促氧化。还有一些其他的氧化剂如抗坏血酸在体内和体外系统有铁离子存在时也能作为助氧化剂。1978年Chen和Chang发现几内亚猪肉中增添的抗坏血酸具有助氧化作用。对这一现象的解释为：当生物分子中的铁结合不紧密时抗坏血酸能促进生物分子（很可能是铁蛋白）中铁的释放。而牧豆树花粉总提物中高浓度黄酮类物质（也有可能是其他成分）的体内助氧化作用的机理还有待考察。在该体系中，可能存在一些其他因素对黄酮类化合物清除自由基有影响。

根据Rice-Evans的研究，酚类成分对氧化反应的抑制作用可能与这些化合物能够直接清除脂氧自由基和过氧自由基有关。高浓度的牧豆树花粉黄酮提取物自身引起的助氧化作用与黄酮提取物在溴苯致毒模型中的抗氧化作用具有显著差异，这一差异表现在：在第二组实验（即抗氧化作用显著的实验组）中黄酮类化合物把氢传递给脂氧自由基和过氧自由基更具优势，所以黄酮类化合物起抗氧化作用而非助氧化作用。

表3样品对溴苯诱导致毒小鼠肝脏的保护作用

在体内实验中，所有的牧豆树蜂花粉提取物（黄酮醇浓度分别为21.751和9.794 μg/ml）都对溴苯引起的脂质过氧化反应表现出了抗氧化作用。低浓度黄酮醇的提取物使脂质氧化减少了19.4%；高浓度黄酮醇的提取物使脂质氧化减少了32.1%。结果表明，牧豆树蜂花粉提取物中黄酮醇的浓度与其抗氧化能力具有一定的关系。但是，所有提取物在体内的抗氧化力都比维生素E要低（维生素E为88.08%），可能是因为槲皮素对链式脂质过氧化自由基的清除率显著低于维生素E，且花粉提取物的各成分间也并未表现出协同效应。我们的实验结果不同于Zhang和Shen（1997）报道的茶多酚与维生素E在体内具有相同的脂质过氧化反应抑制力。

由于未进行更深入的研究，目前也还没有关于花粉提取物体内抗氧化力的其他数据，所以未对不同种属来源的花粉的抗氧化力进行比较。但基于我们使用相同的MDA-TBA的方法对牧豆树花粉提取物脂质氧化抑制力的评价，可以比较这一种属花粉体外生物系统和体内系统的抗氧化力的差异。研究表明，在体外系统中牧豆树蜂花粉提取物脂质过氧化反应抑制力为0.07 μg/ml（以IC50值表示）。即在无氧化剂存在的情况下，每降低50%的MDA的生成需要牧豆树花粉的黄酮醇浓度为0.07 μg/ml，而体内系统中黄酮醇浓度为21.751 μg/ml的提取物仅能降低32%的MDA生成量。

4 结论

牧豆树蜂花粉的乙醇总提物作为体内脂质过氧化反应的抑制剂具有显著作用，可以视为氧化应激的外源性防卫，尽管其活力低于维生素E，同样也低于其在体外肝微粒体生物系统中表现出来的活力。牧豆树花粉酚类化合物组成独特，是一种重要的天然抗氧化剂来源。从黄酮醇浓度和抗氧化力的关系可以看出，牧豆树蜂花粉中的黄酮醇类化合物对其抗氧化力有一定影响。体外生物系统中抗氧化能力并不代表真实的体内活动，所以对体内抗氧化活动做更进一步的研究非常有必要。在未诱导氧化应激的情况下，高浓度黄酮醇的牧豆树蜂花粉提取物可以视为体内氧化剂。