五波长高效液相色谱指纹谱定量鉴定速效救心丸

2012-09-06孙国祥赵梓余

中成药 2012年5期

孙国祥，赵梓余

(沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016)

速效救心丸是由川芎、冰片等制成的滴丸剂，用量小、起效快、服用方便，是治疗冠心病和心绞痛常用药物［1-2］。川芎辛、温，具有止痛、活血、行气作用。冰片辛、苦，微寒，具有开窍醒神、清热、止痛作用。两者合用，可充分发挥两药辛香走窜之力，以达活血化瘀、开窍醒神之功［2］。中药部颁标准中用TLC鉴定川芎成分并用GC法测定冰片中成分含有量［1］。文献中测定其中金属元素［3］和氟［4］，利用红外光谱进行聚类分析研究［5］。曾用单波长HPLC数字化指纹谱评价其质量，本实验建立五波长HPLC指纹图谱对其质量进行控制。中药色谱指纹图谱必然走向对中药进行整体定量控制，系统指纹定量法是鉴定中药整体化学物质的简便可靠方法［6］。通过建立五波长HPLC指纹图谱对速效救心丸进行全面质量评价，充分挖掘全指纹在最佳波长下信息，以增强方法灵敏度和准确度。

1 仪器、试剂与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，ChemStation工作站(Agilent科技有限公司)，Sarturius-BS110S分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂)，乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为去离子水。

阿魏酸对照品(Ferulic acid，FA，批号 0773-9910)，购自中国药品生物制品检定所。藁本内酯对照品(Ligustulide，LGS，纯度不低于 99.2%，自制)。12批速效救心丸(天津中新药业集团股份有限公司第六制药厂)，批号:S1(616062)、S2(619256)、S3(610064)、S4(619166)、S5(619187)、S6(619254)、S7(610020)、S8(610097)、S9(619240)、S10(610013)、S11(610098)和 S12(610031)。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件大连江申CenturySIL C18BDS柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相 A 为水 -0.1%磷酸，B为乙腈-0.1%磷酸;梯度洗脱(0～15 min，5% ～15%B;15～30 min，15% ～30%B;30～50 min，30% ～50%B;50～60 min，50% ～65%B;60～70 min，65% ～85%B;70 ～90 min，85%B);体积流量1.0 mL/min;检测波长 265 nm，276 nm，290 nm，300 nm和310 nm;柱温(30±0.15)℃;进样量20 μL;洗脱时间90 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液用甲醇配制40 μg/mL阿魏酸对照品溶液，同法配制50 μg/mL藁本内酯对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取速效救心丸10粒，精密称定，加体积分数75%乙醇溶液定容至10 mL，超声5 min，摇匀，作供试液。

2.3 系统适用性试验将S1样品溶液，阿魏酸和藁本内酯对照品溶液分别进样20 μL，记录谱图，见图1。确定6号峰为阿魏酸，21号峰为藁本内酯，选藁本内酯峰作参照物峰，其理论板数应不低于38万。2 h空针图证明无干扰峰，依据2 h供试液图确定洗脱90 min。

图1 速效救心丸HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Suxiao Jiuxin Pill

2.4 精密度、重复性及稳定性试验按上述色谱条件，取S1供试液连续进样6次测定精密度;配制S1供试液6份进样测定重复性;分别在S1样品供试液制备后0、5、10、15、20、24 h 进样测定稳定性。以藁本内酯峰的保留时间和峰面积为参照，计算五波长下各指纹峰的相对保留时间RSD＜2.0%和相对峰面积的RSD＜5.0%。结果表明精密度和重复性良好，样品在24 h内稳定。

2.5 系统指纹定量法和鉴定标准［7-8］系统指纹定量法是用宏定性相似度Sm整体监测化学指纹数量和分布比例，用宏定量相似度Pm整体监测化学指纹整体出峰数和峰高，用指纹均化性变异系数α绝对值限定指纹变异性。用三者大小可定量鉴定中药质量，见表1。

表1 中药质量级别鉴定标准Tab.1 The criteria of TCM quality grades

2.6 速效救心丸五波长HPLC指纹图谱建立将12批供试液进样分析并记录色谱图，见图2。以藁本内酯为参照物，按峰出现率70%(S/N≥5)计，确定指纹峰为 29(265 nm)、31(276 nm)、29(290 nm)、27(300 nm)和24(310 nm)。将290 nm 图谱积分AIA文件导入软件按均值法生成准对照指纹谱(PRFP)并评价12批样品，以Sm和Pm为指标进行聚类分析得 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10和S12为第Ⅰ类，S8和S11为第Ⅱ类。依据Sm和Pm接近，故选第I类10批样品按均值法生成五波长下对照指纹谱 (RFPs)，再次评价各波长下速效救心丸质量见表2。

图2 在5个波长下12批速效救心丸HPLC指纹谱和其对照指纹谱Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches of Suxiao Jiuxin Pilland theRFPsunder five wavelength

2.7 用FW-HPLC-FP评价速效救心丸［9］在265、276、290、300、310 nm 波长检测 12 批样品Sm，Pm和α见表2，分别以五个波长的对照指纹图谱作参照。横向比较12批样品在任一波长检测到的化学成分数量、分布比例和指纹比例变异情况都较相似，但各成分含有量有显著差异导致质量级变化。纵向比较同一样品在不同波长质量有显著差异，说明任何单波长指纹谱鉴定质量结果具有片面性，必须对不同波长结果进行合理整合。

2.8 均值法(AM)和主成分整合法(PCI)评价速效救心丸将五波长下的Sm，Pm和α取均值重新评价12批速效救心丸见表2。主成分分析是应用广泛的多元统计方法，用于简化数据，快速实现模式或关系的可视化识别［10］。利用SPSS 16.0分别以Sm、Pm和α值与不同的波长组成矩阵进行主成分分析，以特征值大于1为提取标准，分别得到1、1、3个主成分，主成分的累计贡献率大于90%。计算时将原始数据利用因子系数得分矩阵重新整合［11］得到新的Sm、Pm和α，再次评价速效救心丸质量级，其结果与均值法鉴定结果完全一致，相互验证。AM和PCI鉴定出S12(2级)质量很好;S3、S4、S6和S7(3级)质量好;S10(5级)质量中等;S1和S9(7级)质量次;S2、S5、S8 和 S11(8级)质量劣。

3 讨论

速效救心丸中主要化学成分有生物碱类川芎嗪、有机酸类阿魏酸和内酯类藁本内酯等，在260～320 nm附近有较强紫外吸收，任何单波长指纹谱无法对速效救心丸进行准确表征。多波长指纹谱能实现指纹谱信息最大化，从DAD所记录190～400 nm色谱图中选取重点波长 265、276、290、300、310 nm建立速效救心丸五波长谱可最大限度获取该制剂中复杂化学指纹定性定量全信息。12批药物中一批整体指纹含有量过低，三批含有量过高。本实验结果表明中国药典仅规定几个指标成分含有量下限做法显然不科学，其严重忽视因化学指纹含有量过高而导致的用药不安全问题。