陈 婷， 宿树兰， 钱叶飞， 尚尔鑫， 朱华旭， 段金廒

(1.南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏南京 210046;2.江苏大学药学院江苏镇江 212013)

药对 (又称对药)是临床上常用的相对固定的两味药物的配伍形式，是方剂组成的核心和基本结构，是连接中药和方剂的重要桥梁。乳香、没药常相须为用。乳香辛苦性温，气香窜，偏入气分而善于调气，止痛力强。没药苦平，气淡薄偏入血分，而长于散瘀，破泻力大。二药合用气血并治，相得益彰，功增效宏 (陈维华《药对论》)［1］。在临证中，不少方剂均是乳香、没药并用以协同增效。朱南荪经验治疗子宫内膜异位症、膜样痛经，二药相伍为首选之品，其散瘀止痛作用佳;顾丕荣经验二药配伍止痛作用优于香附、元胡，又能敛溃疡;慢性腹泻久而不愈， “水病及血”、 “血病及水”用二药可改善局部血行，生肌护膜止泻;陈耀堂善用二药化瘀止泻［1-3］。乳香、没药在治疗症瘕积聚、各种癌性疼痛，无论内服和外用均有良效。可见，在临床运用乳香和没药时，常取其相须配伍，增强疗效，发挥治疗疾病的作用，但其配伍协同增效物质基础与作用机制尚待阐明。

从现代科学认知水平看，中药汤剂是科学内涵十分丰富的物理化学体系，汤液在水煎煮过程中溶入水体的各药味所含许多小分子成分如黄酮、蒽醌、生物碱、皂苷、萜类、强心苷、有机酸及其盐等，生物大分子物质如蛋白质、多糖等，以及部分无机元素等，均影响和改变着汤液的理化参数;中药汤剂的临床疗效不仅与汤剂的组成、化学成分和相关剂量有关，与其本身的理化性质 (如pH值、电导率、浊度、黏度、盐度等)也密切相关［4-7］。本实验以药对乳香-没药为研究对象，考察乳香-没药配伍前后汤液的理化参数及其化学组成，探讨两者之间的关联关系和规律性，为深入研究乳香-没药配伍协同增效的物质基础与作用机制提供一定参考。

1 材料

1.1 仪器 DDSJ2308A电导率仪 (上海精密科学仪器有限公司);SZD22型智能化散射光浊度仪(上海自来水设备工程公司);NDJ21型旋转黏度计 (上海精密科学仪器有限公司);雷磁PHS-2F PH计 (上海精密科学仪器有限公司)。ACQUTYTMUPLC系统—PDA检测器 (Waters公司);SynaptTMQ—TOF质谱仪 (Waters公司)，配有 Lock-spray接口;电喷雾离子源 (ESI);电子天平 (BT125，赛多利斯科学仪器有限公司);EPED超纯水系统(南京易普达易科计发展有限公司)。

1.2 试剂 甲醇为色谱纯，购自江苏汉邦科技有限公司;甲酸为分析纯，购自Merck公司;乙腈为色谱纯，购自美国Tedia公司;重蒸水自制。

1.3 药材 乳香、没药药材均购于南京市药业股份有限公司，收集地为广东，经南京中医药大学段金廒教授鉴定，乳香为橄榄科植物卡氏乳香树Boswellia carteriiBirdw的胶状树脂 (批号:091102);没药为橄榄科植物没药树Commiphora myrrhaEngl茎干皮部渗出的油胶树脂 (批号:090824)。符合《中国药典》(2010年版)项下规定。

2 方法

2.1 样品溶液的制备 称取乳香，没药，乳香-没药 (1∶1)各500g，各药材分别加水煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡30 min，煎煮2h，第2次加8倍量水，煎煮1.5h，合并2次水煎液并调整为1 mL相当于0.25 g生药的溶液，即供测试样品溶液。具体见表1。

表1 供测试样品溶液Tab.1 Test sample solution

2.2 理化指标的测定

2.2.1 电导率测定方法 取样品20 mL，在溶液温度为20、40、60℃时分别测定其电导率。

2.2.2 盐度测定方法 取样品20 mL，在恒温水浴中保持10 min，测定其20、40、60℃时的盐度。

2.2.3 浊度测定方法 取样品50 mL，在溶液温度为20、40、60℃时，以SZD22型浊度仪分别测定样品浊度值。

2.2.4 黏度测定方法 取样品150 mL，在溶液温度为20、40、60℃时，以NDJ21型旋转式黏度计分别测定样品的黏度值。

2.2.5 pH值测定方法 取样品20 mL，以校正过PHS-2F实验室精密pH计测定样品的pH值。

2.3 UPLC-MS分析

2.3.1 供试样品的制备 取上述样品溶液样1、样2、样3、样4各50 mL，用色谱甲醇醇沉至80%，取上清液，13 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜即得供试样品，4℃保存，待测。

2.3.2 超高效液相色谱条件 AcquityTMUPLC BEH C18色谱柱 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm);柱温30℃;体积流量0.4 mL/min;进样量1 μL;流动相为乙腈 (A)-0.1%甲酸水 (B)，梯度洗脱 (0～1 min，5%A;1～12 min，60%A;12～15 min，35%A;15～20 min，5%A;20～21 min，5%A;21～22 min，95%A;22～23 min，95%A)。

2.3.3 质谱条件 采用电喷雾电离离子源 (ESI)，负离子V模式检测;m/z:100～1 000;毛细管电压为3.5 kV;锥孔电压为35 kV;离子源温度为120℃;雾化温度为350℃;氮气体积流量为900 L/h。

2.4 汤液理化参数与化学成分关联分析方法 研究两个或多个变量之间的关系时，常常用到回归分析;而多元线性回归分析是研究多个自变量x和一个因变量y之间是否存在线性关系以及存在线性关系的类型，从而建立多元线性回归方程:y=b0+b1x1+b2x2+…+bmxm。在多元线性回归方程中，可能自变量对应变量的影响很强或影响很弱，甚至完全没有影响，故需要对自变量进行筛选，尽可能将回归效果显著的自变量选入回归方程，将作用不显著的自变量剔除在外。逐步回归分析正是根据这一原则提出的一种回归分析方法。使用逐步回归分析方法拟合线性回归模型，避免了在自变量较多时选择的繁琐性。本实验采用逐步回归分析的方法，对汤液理化参数与化学成分间的多因变量和多自变量之间的相关性进行分析。化学成分以峰面积作为相对含有量进行分析。

3 结果

3.1 乳香-没药配伍前后汤液表观理化参数的分析比较 见表2。

表2 乳香-没药配伍前后汤液表观理化参数Tab.2 Physiochemical parameters of Olibanum and Myrrha decoction

由表2数据分析，乳香-没药配伍后电导率明显增加，随着温度的升高电导率也呈上升趋势。据此推测，乳香-没药对药配伍可能使汤液中带电胶体粒子浓度降低，使得汤液的电导率增加。电导率是衡量溶液体系离子浓度的指标，也是描述胶体溶液体系变化的重要指标，与中药提取液中的带电胶体粒子 (如蛋白和鞣质)密切相关，可有效表征分散体系的稳定性。有研究认为，形成离子对后，药物的亲脂性增强，有利于透过生物膜，可促进带电药物的吸收，因此，电导率也是影响药物吸收的因素之一［8］。

由表2的数据可看出，乳香水煎液的黏度较大，乳香与没药配伍后水煎液的黏度下降，两药单煎液混合后黏度也有所下降;随着温度的升高各样品的黏度都呈显著下降趋势。提示乳香、没药水煎液中含有大量树脂、树胶类物质，随着温度的升高可能发生水解或生成水溶性络合物使得汤液的黏度下降，大分子的树脂、树胶类物质可与微量元素形成水溶性络合物［9］。黏度又称黏性系数、动力黏度，是度量流体黏性大小的物理量。黏度是流体的一种属性，不同流体的黏度数值不同。在中药水煎液中，高分子物质 (如淀粉、黏液质、果胶等)的含有量与药液的黏度密切相关。有研究报道，药物分散体系的黏度对其吸收有一定的影响［10］。

浊度反映溶液体系中粒径大小不同、相对密度不同的悬浮物与胶体物质的含有量［11］。表2中的数据显示，乳香单味药水煎液的浊度较没药水煎液大，乳香与没药配伍后水煎液的浊度显著降低;单味药水煎液混合之后浊度也有所下降;随着温度的升高各样品的浊度呈下降趋势，但变化不甚显著。

盐度是一种溶剂中以离子形式存在的物质的质量［12］。由表2可见在室温 (20℃)下，乳香、没药单味药水煎液以及混合液的盐度值均为0 ppt，乳香、没药配伍之后水煎液的盐度呈增加趋势。随着温度的上升各样品溶液的盐度均显著增加。表明各汤液中以离子形式存在的成分仅占少数，提示汤液中小分子成分多以络合或被大分子物质吸附的方式存在，但是温度升高可能导致小分子物质的溶出而呈高分子状态。

给药体系的pH值不同可以改变药物尤其是弱电解质药物的解离度，从而影响药物透过生物膜的难易程度，未解离的分子型药物比离子型药物易透过生物膜［8］。表2的数据显示，各样品的pH值均在4左右，随温度的变化pH值变化不明显。

3.2 乳香-没药配伍前后汤液理化参数与化学成分的相关分析

3.2.1 乳香-没药配伍前后汤液中化学成分的分析与鉴定结果 通过与部分对照品 (化合物7、15)的UV吸收、质谱特征等定性分析比较，确定汤液中含有呋喃型倍半萜类化合物;西松烷型二萜类成分 (二萜醇);四环三萜类化合物 (达玛烷型四环三萜醇、羊毛脂甾烷型四环三萜醇、甘遂烷型四环三萜酸);五环三萜类成分 (齐墩果烷型五环三萜酸、乌苏烷型五环三萜酸、乌苏烷型五环三萜醇酸、羽扇豆烷型五环三萜酮);脂肪族醇苷等化合物。汤液总离子流色谱图见图1，已鉴定出的化合物见表3，图2。

3.2.2 乳香-没药配伍前后汤液理化参数与化学成分的相关分析结果 采用逐步回归的分析方法对汤液中所检测到的化学成分的相对含有量与汤液理化参数进行相关性分析。逐步回归法是向前回归法和向后回归法的一种结合，其基本思想是:将变量一个个地引入，引入的条件是该变量的偏F检验是显著的，同时，每引入一个新变量后对旧变量逐个检验，将变化不显著的变量从回归模型中剔除［25-27］。观察汤液的表观理化参数测定值，对汤液影响较为显著的理化参数指标为浊度和黏度。首先，以浊度作为因变量y1，化学成分的相对含有量作为自变量x，建立逐步回归模型，自变量x见表3。采用spss16.0软件进行逐步回归分析，所得回归方程为:

图1 乳香-没药配伍前后及其混合汤液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram for Olibanum and Myrrha decoction

表3 乳香-没药配伍汤液中化学成分鉴定结果Tab.3 Identification results on chemical components of Olibanum and Myrrha decoction

图2 乳香-没药配伍水煎液中已鉴定的化学成分结构式Fig.2 Structure formulation on chemical components of Olibanum and Myrrha decoction

回归方程 (1)表示汤液的理化参数指标浊度y1在很大程度上可以由五环三萜酸酯类化学成分的含有量 (x3)所决定，由回归方程可见五环三萜酸酯类成分x3与浊度y1成正相关，且相关系数为0.997 1，说明相关性较好，见图3。由回归分析图显示，3-乙酰乳香酸 (x3)的含量影响汤液的浊度，随着各汤液中3-乙酰乳香酸的增加，各汤液的浊度值也上升。

以黏度作为因变量y2，化学成分的相对含量作为自变量x，再次建立逐步回归模型，自变量x见表3。同样采用spss16.0软件进行逐步回归分析，得回归模型:

回归方程 (2)表示理化参数指标黏度y2在很大程度上由化合物4的含有量(x4)所决定，回归方程表明化合物4x4与黏度y2成负相关，且回归模型的相关系数为0.996 3，说明相关性较好，见图4。

图3 化学成分x3与浊度参数的回归分析Fig.3 Regression analysis between turbidity and chemical component x3

图4 化学成分x4与黏度参数的回归分析Fig.4 Regression analysis between viscosity and chemical component x4

质谱图显示化合物4的质谱特征:分子离子峰为m/z281［M-H］-，特征碎片离子m/z:267、233、187、169、146、113(100)，经推断可能是没药中的倍半萜类化合物，由图4可见，化合物4的含有量影响着汤液的黏度，随着汤液中化合物4的增加，汤液的黏度呈下降趋势。

3.3 乳香-没药配伍汤液理化参数与汤液中化学成分含有量变化相关性的验证试验 乳香-没药配伍汤液中分别加入10 mg的Acetyl elemolic acid(五环三萜酸酯类化合物)、2-Methoxy-5-acetoxy-fruranogermacr-1(10)-en-6-one(倍半萜类化合物)，测定原汤液与加入不同类型化合物汤液的汤液浊度与黏度，结果见表4。结果显示，加入Acetyl elemolic acid的配伍水煎液其浊度较原汤液浊度为高，加入2-Methoxy-5-acetoxy-fruranogermacr-1(10)-en-6-one的配伍水煎液黏度值比原汤液为低，实际测得的理化参数值的变化趋势与逐步回归分析的结果相一致。

表4 原液与加入不同化合物汤液的浊度与黏度Tab.4 Turbidity and viscosity of the decoction and added with different compounds

4 小结与讨论

4.1 化学成分在汤液中的存在状态与理化性质的关系

4.1.1 萜类成分在汤液中的存在状态与理化性质的关系 萜类化合物是芳香类药物的主要活性物质。乳香、没药均为芳香类药物，为汤液提供了丰富的单萜、倍半萜类挥发性成分以及大量的三萜酸、三萜醇、三萜酯类物质。在汤液煎煮过程中单萜、倍半萜类挥发性成分进入汤液中溶解释放形成饱和芳香水性有效地促进了其他亲脂性和中等极性成分的转移溶出，使得汤液理化参数发生了变化;汤液中的五环三萜酸酯类成分可能被很好的溶解，也可能在煎煮过程中与汤液中的其他成分结合或发生反应，形成水中溶解度较小的盐、复合物或树脂类成分，导致汤液的理化参数发生变化，进而影响着药效物质群在体内的代谢过程，从而影响汤液临床疗效的发挥［28-29］。

4.1.2 树脂类成分在汤液中的存在状态与理化性质的关系 乳香、没药药材是较为常见的树脂类药材，树脂是由植物体内的挥发油成分如萜类经过复杂的化学变化如氧化、聚合、缩合等作用而形成的一类化学组成较复杂的混合物，包括树脂酸、树脂醇、树脂酯、树脂烃等多类型化合物［30］。乳香、没药配伍前后水煎液中主要含有的树脂类物质有:没药挥发油类成分，主要由单萜和倍半萜成分组成［30］;没药树胶类成分，主要包含阿拉伯糖、半乳糖、木糖、3-O-甲基葡萄糖醛酸等［31］;乳香三萜类成分，主要是乳香酸类五环三萜化合物和四环三萜化合物［32］。汤药在煎煮过程中，乳香中存在的三萜树脂醇类物质与没药树脂酸类成分或没药中含有的肉桂酸、苯甲酸等芳香酸类物质结合成酯;汤液中的油胶树脂 (树脂中含有较多的挥发油)，在煎煮过程中油胶树脂被破坏导致挥发油溢出。汤液的这些变化在一定程度上都影响着汤液的理化参数，同时也影响着汤液临床疗效的发挥。

基于乳香-没药的研究表明，在适宜的温度、pH值、离子强度等理化条件时，汤液的生物大分子可能由于部分基团的相互连接，表现为各种理化参数的变化。

4.2 汤液理化性质与乳香-没药配伍协同增效的关系 由表2可见乳香-没药配伍后可溶性物质或电解质增加了，乳香、没药中发挥作用的许多化学成分，如提取分离获得的单体化合物，其水溶性较弱，但在两药配伍的复杂化学体系中，多种成分的相互助溶作用，使得它们很好的溶解在水中。没药中含有肉桂酸、苯甲酸等芳香酸类活血化瘀成分，芳香酸是有机酸的一大类，是一类较好的助溶剂［33］，使得乳香、没药中许多有效成分较好的溶出，增加了乳香、没药在活血化瘀方面的功效。

表2数据表明乳香-没药配伍后盐度值仅有微小的变化，煎液中以微量离子形式存在的物质不足以引起盐度的变化。随着温度的升高各样品溶液的盐度都有一定程度的上升，提示乳香、没药中有机酸类、苷类及苷元等成分的存在影响了溶液的盐度，但盐度的变化与乳香-没药配伍增效的关系还有待进一步研究。

理化参数中浊度和黏度的变化显示，乳香-没药配伍后使得单味药中不溶性成分大量溶解对促进药物的吸收大有益处，随着温度的升高，增大了部分难溶物质的溶解度，但变化不明显。乳香、没药水煎液中含有多糖、胶状物等，使得汤液黏度较大，汤液中存在的某些可溶性多糖类物质，在一定条件下逐渐自然聚合成大分子，以胶体形式 (又称软固体)存在于汤液中，乳香-没药配伍后黏度值明显降低，促进了某些可溶性大分子物质的溶解［32-33］。

各样品溶液的pH值随着温度的改变未见明显变化，pH值与乳香-没药配伍增效之间的关系有待深入探讨。

由于实验受样本量限制仅找到两类化学成分与理化参数强相关，这两类化学成分与验证实验是同类化合物，可提示乳香-没药配伍汤液中五环三萜酸酯类成分影响着汤液的浊度并且与浊度成显著正相关，倍半萜类成分影响着汤液的黏度并且与黏度成显著负相关。

本实验以药对乳香-没药为例，探讨了乳香-没药配伍前后汤液物理化学性质的变化及其相关性，研究结果为汤剂复杂化学体系的有效表征提供了一定参考，为深入研究乳香-没药配伍前后化学成分的组成及其存在状态，以及与效应之间的关系提供一定依据，为揭示乳香-没药的效应物质基础及作用机制提供了实验基础。

［1］胥庆华，刘丽云，赵瑞华，等.中药药对大全［M］.北京:中国中医药出版社，1996.369-371.

［2］陈健德，洪燕珠.中药药对的研究进展与思考［J］.陕西中医学院学报，2007，8(4):56-57.

［3］叶建红.对药乳香没药药理作用与临床应用体会［J］.安徽中医临床杂志，2003，15(3):264-265.

［4］田军军，刘 莹，冯广义.中药汤剂煎煮法和有效成分溶出率关系探讨［J］.吉林中医药，2008，28(5):373-374.

［5］姚薇薇，朱华旭，郭立玮.1万PS膜对黄连解毒汤不同药物组合物理化学参数影响的初步研究［J］.南京中医药大学学报，2006，22(6):359-361.

［6］柳 扬，姚薇薇，郭立玮.AB-8大孔树脂对黄连解毒汤不同药物组合物理化学参数影响的初步研究［J］.化工时刊，2006，20(9):10-13.

［7］苏德森.物理药剂学［M］.北京:化学工业出版社，2004:298.

［8］宿树兰，段金厫，朱华旭，等.基于少腹逐瘀汤不同组合分析其理化参数与化学组成的变化特性［J］.中国中药杂志，2011，36(9):18-23.

［9］孙为银.配位化学［M］.北京:化学工业出版社，2004:206.

［10］马雪松，谭 蔚，朱企新.过滤分离技术应用于中药提取液的实验研究［J］.过滤与分离，2005，15(4):10.

［11］陈丹丹，郭立玮，刘爱国，等.0.2 μm无机陶瓷膜微滤枳实、陈皮水提液理化参数与通量变化关系的研究［J］.南京中医药大学学报，2003，19(3):151.

［12］曹桂萍，李 博，郭立玮，等.不同温度下超滤对中药含油水体物理化学参数影响的初步研究［J］.化工时刊，2008，22(9):14-17.

［13］Francis J A，Raja S N，Nair M G.Bioactive terpenoids and guggulusteroids fromCommiphora mukulgum resin of potential antiinflammatory interest［J］.Chem Biodivers，2004，1(11):1842-1853.

［14］Patil V D，Nayak U R，Sukh D.Chemistry ofayurvediccrude drugs-Ⅱ:Guggulu(resin fromCommiphora mukul)-2:diter-penoid constituents［J］.Tetrahedron，1973，29(1):341-348.

［15］Frank A，Unger M.Analysis of frankincense from variousBoswelliaspecies with inhibitory activity on human drug metabolising cytochrome P450 enzymes using liquid chromatography mass spectrometry after automated on-line extractin［J］.J Chromatogr A，2006，1112(1/2):255-262.

［16］Berthold Büchele，Waltraud Zugmaier，Thomas Simmet.Analysis of pentacyclic triterpenic acids from frankincense gum resins and related phytopharmaceuticals by high-performance liquid chromatography.Identification of lupeolic acid，a novel pentacyclic triterpene［J］.J Chromatogr B，2003，791(1/2):21-30.

［17］Mathe C，Culioli G，Archier P，et al.Characterization of archaeological frankincense by gas chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2004，1023(2):277-285.

［18］Manguro L O A，Opiyo S A，Herdtweck E，et al.Triterpenes ofCommiphora holtzianaoleo-gum resin［J］.Can J Chem，2009，87(8):1173-1179.

［19］Dekebo A，Dagne E，Hansen L K，et al.Two octanordammarane triterpenes fromCommiphora kua［J］.Phytochemistry，2002，59(4):399-403.

［20］Manguro L O A，Ugi I，Lemmen P，Dammarane Triterpenes ofCommiphoraconfuse Resin［J］.Chem Pharm Bull，2003，51(5):483-486.

［21］Shen T，Wan Wenzhu，Yuan Huiqing，et al.Secondary metabolites fromCommiphora opobalsamumand their anti-proliferative effect on human prostate cancer cells［J］.Phytochemistry，2007，68(9):1331-1337.

［22］Norihiro B，Toshihiro A，Ken Y，et al.Anti-inflammatory activities of the triterpene acids from the resin ofBoswellia carteri［J］.J Ethnopharmacol，2006，107(2):249-253.

［23］Toshihiro A，Keiichi T，Norihiro Banno，et al.Cancer chemopreventive effects and cytotoxic activities of the triterpene acids from the resin ofBoswellia carteri［J］.Biol Pharm Bull，2006，29(9):1976-1979.

［24］Pardhy R S，Bhattacharyya S C.Tetracyclic triterpene acids from the resin ofBoswellia serrataRoxb［J］.Indian J Chem，1978，16B:174-175.

［25］罗凤明，邱劲飙，李明华，等.如何使用统计软件SPSS进行回归分析［J］.电脑知识与技术，2008(2):293-294，304.

［26］刘云香，刘 刚.Matlab中多元逐步回归分析在肝阳化风症状敏感性研究的应用［J］.电脑知识与技术，2010，6(34):9876-9878.

［27］唐于平，段金厫，丁安伟，等.中医方剂物质基础现代研究的策略［J］.中药现代化，2007，9(5):20-24.

［28］肖春芬，周 莉，娄兆文.国内有关数种中药有效成分间相互作用的研究现状［J］.中国药房，2007，18(15):1180-1181.

［29］Prakash O，Singh G N，Singh R M，et al.Interactions of herbal extract combinations against free radical scavenging activity［J］.Pharm Biol，2009，47(8):729-733.

［30］宿树兰，王团结，段金厫.常用树脂类药材资源分布、化学成分及药理活性研究进展［J］.国际药学研究杂志，2009，36(2):109-114.

［31］万文珠，娄红祥.没药的化学成分和药理作用［J］.国外医药·植物药分册，2005，20(6):236-241.

［32］崔 锐，周金云.乳香化学和药理的研究进展［J］.中国药学杂志，2003，38(6):407-410.

［33］唐于平，段金廒，范欣生，等.芳香酸类成分在活血化瘀方中的作用分析［J］.世界科学技术-中医药现代化，2008，10(4):38-42.