徐伟丽，马 莺

(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，150090哈尔滨)

近年来，分子生物学技术已成功用于物种鉴别，其中的聚合酶链式反应(PCR)技术更是广泛应用于食品原料物种鉴别、饲料中动物源性成分的鉴别和掺伪检验.核酸分子是PCR技术应用的主要对象，所以，DNA的分离与提取是该项技术的重要前提［1-4］.反刍动物奶中含有体细胞(包括白细胞和乳腺上皮细胞).有研究表明，这些细胞可以作为DNA来源用于PCR扩增特定靶序列的区别动物物种［5-9］.目前，对于植物和动物组织全基因组DNA的提取方法已有不少研究和报道［10-19］.奶粉不同于一般的植物和动物组织材料，适宜的提取方法也不同.能够更有效地提取更高质量的奶粉基因组DNA方法的筛选，是一个需要进一步探讨的问题.

目前关于奶粉中全基因DNA的提取国外尚无报道，国内仅有岳巧云等［20］采用 Plant DNA Wizard纯化试剂盒(Promega公司)提取奶粉中的基因组DNA用于实时荧光PCR法对奶粉中的豆粉进行检测.此方法具有费用高、费时、对操作技能有较高要求等缺点，因此，需要发展简单、快速、成本低的奶粉基因组DNA提取方法.而采用不同方法提取奶粉基因组DNA的比较研究目前国内外尚无报道.本实验选择热解法、异丙醇沉淀法、CTAB(cetyl-trimethyl-ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(sodium dodecyl sulphate，十二烷基硫酸钠)法和高盐低pH值法、异硫氰酸胍法6种方法，以市售奶粉为材料，进行基因组DNA提取，通过提取效果比较，探讨适用于奶粉的基因组DNA提取方法.为乳品安全中利用PCR技术进行快速检测找到简单、稳定、优质的DNA提取方法.

1 实验

1.1 实验材料

全脂奶粉购于超市，于阴凉干燥处储存备用.开封后分装，于4℃保存.

1.2 试剂

Tris Base、EDTANa2、SDS、CTAB、异硫氰酸胍、Triton X-100、Tris平衡酚、琼脂糖 G-10、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇及PCR试剂均购于哈尔滨宝泰克生物科技有限公司.

1.3 主要仪器

TGL-16G型台式离心机、DK-80型电热恒温水槽、WFZ UV-2100型紫外可见分光光度计、DYY-10型(ECP3000)三恒电泳仪、TAKARA TP600 PCR仪、Bio-RAD Universal HoodⅡ凝胶成像仪和电脑750 W微波炉均为本实验室仪器.

1.4 引物

参照文献［21］合成扩增牛12SrRNA基因设计特异性引物cow-1:5'-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT-CGATAA-3';cow-2:5'-AAATAGGGTTAGATGCACT-GAATCTAT-3'，扩增产物 344 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.5 DNA提取方法

热解法、异丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高盐低pH法、异硫氰酸胍法的具体步骤见文献［1，3］.

1.6 基因组DNA纯度和质量浓度检测

［1，3］进行检测.根据ρ(DNA)/(mg·L-1)=50×D(260nm)×501计算DNA质量浓度;根据D(260nm)/D(280nm)和D(260nm)/D(230nm)判断DNA的大致纯度.

1.7 琼脂糖凝胶电泳检测

5μL 基因组 DNA与1μL6×Loading Buffer混匀，点样，1.0% 琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，紫外凝胶成像仪观察电泳胶板并拍照.

1.8 基因组DNA用于PCR扩增的适应性检测

参考文献［1-4］的反应体系和条件.用1.7%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.

2 实验结果

2.1 奶粉基因组DNA质量浓度和纯度检测结果

奶粉中基因组DNA的提取结果见表1.可以看出:DNA质量浓度最大的为SDS法(495.833mg/L);其次为异丙醇沉淀法和热解法，分别为302.083和231.250mg/L.高盐低pH法和CTAB法提取的DNA质量浓度最低，分别为31.250和29.167 mg/L.提取得到的DNA的D(260nm)/D(280nm)范围为1.65～1.87，较为理想;若偏高，表明有RNA污染;若偏低，则表明有蛋白或苯酚污染，接近1.80效果最好［22-23］.表中数据也表明CTAB法和异丙醇沉淀法提取的基因组DNA的纯度较高，其他4种方法均较低.因此，也不能排除由于杂质的影响而使DNA质量浓度的测量结果偏大的可能.

表1 奶粉基因组DNA的质量浓度和纯度

2.2 奶粉基因组DNA的琼脂糖电泳检测结果

奶粉基因组DNA的质量浓度和纯度进一步采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1.CTAB法提取的奶粉基因组DNA谱带单一，无碎片和连片;重复试验的DNA条带迁移率一致，说明此方法具有较好的稳定性以及此法提取的基因组DNA完整性好.其他5种方法提取的基因组DNA在凝胶上没有出现谱带，其可能原因:一是DNA质量浓度较低;二是没有提取到DNA.

2.3 PCR扩增结果

奶粉基因组DNA的PCR反应结果见图2.结果显示，PCR产物的量不取决于DNA的质量浓度，而是取决于DNA的提取方法.异丙醇沉淀法和SDS法提取的DNA质量浓度较高，却不能得到满意的PCR扩增产物.其他4种方法提取的基因组DNA样品的PCR扩增片段大小与预期一致，且重复性好.说明这4种方法提取的基因组DNA可以直接用于牛特异性片段的PCR扩增.因此，认为这4种方法提取的奶粉基因组DNA均适用于PCR检测.其中热解法和CTAB法特异性条带更清晰，效果更好.

图1 奶粉基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

图2 牛特异性引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

3 讨论

PCR技术以及建立在PCR基础上的分子标记技术，能以微观的视角解释其他技术现在无法解决的问题.但是，由于PCR扩增对模板DNA的质量要求较高，DNA质量是影响分子实验结果的关键因素之一［1-4，18-19］.

在提取奶粉基因组DNA的过程中要注意:奶粉开封后阴凉干燥处保存，避免杂菌污染和吸湿结块;奶粉在进行去蛋白步骤时，颠倒混匀要充分(保持一段时间)，以增加抽提效果;水浴加热时要使管盖高出水面并保持一定的高度，避免Eppordorf管炸开，污染样品.

4 结论

1)奶粉中的DNA含量很少，这6种方法获得的提取物中均有蛋白质污染.

2)热解法、CTAB法、高盐低pH法和异硫氰酸胍法提取的奶粉基因组DNA均适用于PCR检测.综合考虑基因组DNA的纯度和质量浓度，认为这4种方法的优劣依次为:热解法、异硫氰酸胍法、高盐低pH法和CTAB法.

3)这4种奶粉基因组DNA提取方法均具有操作简便、省时、利于快速检测等优点.可以根据具体的实验条件和要求选择相应的DNA提取方法.

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