李向利，宋会新，张术波

（1.迁西县人民医院胸外科，河北 迁西 064300；2.华北煤炭医学院附属医院，河北 唐山 063000）

唐山地区食管癌与人乳头状瘤病毒感染及p53的相关性

李向利1，宋会新1，张术波2

（1.迁西县人民医院胸外科，河北 迁西 064300；2.华北煤炭医学院附属医院，河北 唐山 063000）

目的 研究人乳头状瘤病毒(HPV)在唐山地区食管癌、癌旁组织和正常食管组织中的感染情况和p53表达的关系。方法采用TCT法检测45例食管癌组织、相应癌旁组织和正常食管组织中HPV感染情况，免疫组化SP法检测p53的表达。结果45例食管癌组织、相应癌旁组织和正常食管组织中HPV感染阳性率分别为20.0%、40.0%和6.7%，差异有统计学意义(P＜0.05)，p53蛋白的检出率分别为97.8%、62.2%和4.4%。HPV和p53阳性表达与年龄、性别、TNM分期和淋巴结转移均无明显联系。HPV感染率与p53阳性表达程度呈正相关。结论唐山地区食管癌组织中存在HPV感染，与食管癌的发生、发展有关，与p53的表达有一定的相关性。

食管癌；唐山；人乳头状瘤病毒；p53

食管癌是严重威胁人民生命的肿瘤之一，目前病因仍未明确，可能与生活习惯、遗传因素、自然地理环境和病毒感染等有关。食管癌组织中可检测到人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPVs)，作为第一个被确定为致肿瘤的病毒，HPV与食管癌的关系目前结论不一，不同地区HPV感染率也不等。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，同样也是肿瘤领域研究最广泛的抑癌基因之一[1-2]。为探讨HPV感染及p53的表达与食管癌发生发展的关系，本文通过采用新柏式液基细胞学技术(TCT）和免疫组化检测唐山地区食管癌患者食管癌组织HPV的感染和p53的表达情况，探讨HPV感染在食管癌中和癌旁正常组织中的差异及其与p53表达的相关性，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院胸外科2005年5月至2010年11月收治的45例唐山地区食管癌患者的食管组织标本，有完整的临床资料，其中男性31例，女性14例；年龄45～73岁，平均(56.7±5.8）岁。食管癌组患者按1997年国际抗癌联盟TNM分期标准，Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；无淋巴结转移29例，有淋巴结转移16例。所有病例分别取癌组织、癌旁组织(距癌灶5 cm内)及正常食管黏膜组织制成标本，均经术前快速冷冻病理和术后常规病理检查确诊，术前均行化疗、放疗及免疫治疗。

1.2 方法

1.2.1 HPV的检测 新柏氏TCT检查：将标本采集在干净、干燥的容器中，装入离心管中离心3 min，弃上清液，将细胞保存液加入离心管中混匀倒入保存瓶，震荡混匀，经Thinprep 2000微电脑处理系统程序化处理，制成直径2 cm的薄层细胞涂片，95%乙醇固定10 min，HE染色，封固，镜检。对于有多量血液黏液标本，加入25%冰醋酸3～5滴充分混匀，经过多次梯度程序而清除杂质离心收集细胞，显微镜下观察结果。

1.2.2 免疫组织化学染色试剂与方法 鼠抗人p53单克隆抗体及免疫组织化学染色超敏试剂盒为美国Maxim Bistech公司产品。常规制片4µm厚石蜡切片，进行p53免疫组织化学染色(SP法)，操作步骤按说明书进行。用柠檬酸缓冲液行微波抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为空白对照，已知阳性片作为阳性对照。

1.3 结果判定 均按试剂盒说明术进行，细胞核内棕褐色颗粒为杂交阳性信号。光镜下，p53于细胞核内表达，呈棕褐色或棕黄色颗粒为阳性。在高倍镜下(×400)每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞所占百分比。(-)为无阳性细胞；(+)为阳性细胞数比例＜25%；(++)为阳性细胞数比例25%～50%；(+++)为阳性细胞≥50%。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV的感染和p53的表达 食管癌组织中HPV阳性9例(20.0%)，癌旁组织中HPV阳性18例(40.0%)，正常组织中HPV阳性3例(6.7%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。食管癌组织中p53阳性44例(97.8%)，癌旁组织中p53阳性28例(62.2%)，正常组织中p53阳性2例(4.4%)，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 食管癌组织、癌旁组织和正常组织中HPV的感染和p53的表达情况(例)

2.2 HPV的感染和p53的表达与食管癌临床特征的关系 本组研究中食管癌患者年龄＜55岁病例为20例，HPV表达阳性率为20%(4/20)；≥55岁病例为25例，HPV表达阳性率为20%(5/25)，差异无统计学意义(P＞0.05)。＜55岁病例中，p53表达阳性率为100%(20/20)；≥55岁病例为24例，p53表达阳性率为96%(24/25)，差异无统计学意义(P＞0.05)。食管癌男性病例数为31例，HPV表达阳性率为22.6%(7/31)，女性病例数为14例，HPV表达阳性率为14.3%(2/14)，差异无统计学意义(P＞0.05)。男性病例中，p53表达阳性率为96.8%(30/31)；女性病例中，p53表达阳性率为100%(14/14)，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。据TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期HPV阳性率均为20%，差异无统计学意义(P＞0.05)；Ⅰ期p53表达阳性率为96%(24/25)，Ⅱ期和Ⅲ期HPV的p53表达阳性率均为100%，差异无统计学意义(P＞0.05)。淋巴结转移HPV表达阳性率为18.8%(3/16)；无淋巴结转移病例为29例，HPV表达阳性率为20.7%(6/29)，差异无统计学意义(P＞0.05)。p53的表达在食管癌淋巴结转移阳性病例为16例，p53表达阳性率为100%(16/16)；淋巴结转移阴性病例为28例，HPV表达阳性率为96.6%(28/29)，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 HPV的感染和p53的表达与食管癌临床特征的关系

2.3 食管癌中HPV感染与p53表达之间的关系 运用Spearman相关分析食管癌中HPV感染与p53表达，HPV感染率与p53阳性表达程度呈正相关(r=0.371，P＜0.05)，见表3。

表3 食管癌中HPV感染与p53表达之间的关系

3 讨论

食管癌的发生表现为多阶段、多基因参与的复杂过程，常常发现时已到了中晚期，预后不理想。早发现、早诊断、早治疗是目前对付癌症的有效手段，近年来的研究致力于研究其致病机理，发现各种原因造成的细胞增殖与凋亡作用机制的失衡是肿瘤发生的主要原因[3]。p53基因作为目前研究较成熟的一种抑癌基因，其主要作用是当细胞DNA发生损伤时，它能使细胞分裂终止在G1/S期，从而进行充分的修复，当修复成功后自动回复正常状态。若损伤难以修复，则进入细胞自动凋亡引起程序性死亡。p53基因有野生型和突变型两种，野生型在细胞内的活性是被严格控制的，参与细胞周期的调控，维持正常生理代谢。突变型蛋白半衰期延长，易累积，但却已不是抑癌基因而向癌基因转变。p53基因的失活和蛋白的异常表达会导致细胞生长失去抑制作用或促进细胞的恶变及过度增殖[4]。作为致癌因素之一的HPV感染，其属于乳头状瘤病毒组，分型很多，根据体外研究认为其编码的E6蛋白能与p53蛋白结合形成复合物，使其失去抑癌作用，促使细胞的增殖，故HPV感染可能是其发病的危险因素之一[5]。

本研究显示食管癌、癌旁组织和正常组织中HPV阳性率相比差异有统计学意义。食管癌、癌旁组织和正常组织中p53阳性表达相比差异有统计学意义。与相关研究结果相似，检测食管癌患者中有20%发现HPV感染，提示HPV感染可能和唐山地区食管癌的发生存在联系，癌旁组织中HPV感染率更是高达40%，认为其高表达可促进正常细胞的恶变和食管癌细胞的增殖浸润，考虑野生型p53蛋白半衰期短，具不稳定性，不易检测，突变型p53蛋白其具有癌基因活性，可引起细胞恶性增殖且具有抗凋亡作用，导致细胞转化和肿瘤的发生，使检测成为可能，发生肿瘤时p53蛋白的大量表达均为突变型p53蛋白，其不再具有抑癌作用，而是促进细胞增殖[6-7]。我们发现HPV感染率和p53阳性表达与年龄、性别、TNM分期和淋巴结转移均无明显联系。相关研究认为p53表达与淋巴结转移相关，其表达增加预示预后欠佳，淋巴结转移的可能性大，与本实验不符，考虑本实验p53表达阳性结果高，阴性例数极少，未能有效的体现与临床特征间的差异，可增加样本量再行分析。本实验研究认为HPV感染率与p53阳性表达程度呈正相关，与其他相关研究结果相似，认为HPV感染可破坏细胞增殖与凋亡的平衡，促使p53表达的增加，进而促进细胞恶变增殖。但仍有研究认为HPV感染与不同地区、甚至在同一地区不同地方感染人群所占的百分比不尽相同，与食管癌的关联性仍不好确定，有待于在今后的研究中进一步深入及完善[8]。

综上所述，联合检测二者在食管癌中的表达情况对预测食管癌的生物学行为、指导临床治疗有一定意义，两者可能成为研究食管癌发病机制的有效途径。

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[5]陈云昭,姚恩生,杨 兰.人乳头状瘤病毒感染与新疆哈萨克族食管癌发生关系的探讨[J].现代预防医学,2008,35(13):2407-2409．

[6]何保吕,段广才,蔡 琳.高危型HPV感染和p53基因多态性与食管癌关系的研究[J].海峡预防医学杂志,2007,13(3):8-10．

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[8]陈云昭,姚恩生,杨 兰,等.人乳头状瘤病毒感染与新疆哈萨克族食管癌发生关系的探讨[J].现代预防医学,2008,35(13): 2407-2409．

R735.1

B

1003—6350（2012）20—035—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.20.014

2012-05-23）

河北省唐山市科技计划项目（编号：111302060b）

李向利（1976—），男，河北省迁西县人，主治医师，学士。