陈静宇 ，林新瑜 ，王芳 ，林鸿刚

（1.成都市第六人民医院，成都610051；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，成都610072；3.四川大学国家生物治疗重点实验室，成都 610041）

黄褐斑、白癜风等是临床上常见的色素障碍性疾病，目前其发病机制还不十分清楚,治疗难度也较大。皮肤颜色的深浅主要取决于黑素细胞产生黑素的量和分布。通过黑素细胞的体外纯培养可以研究色素障碍性疾病的发病机制，筛选治疗这些疾病的药物和方法。本研究建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系，采用不同浓度的白细胞介素 4（interleukin-4，IL-4）作用于体外培养的黑素细胞，观察其对黑素细胞增殖及黑素合成的影响，为临床应用IL-4治疗色素性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 MCDB-153培养基，牛胰岛素，人转铁蛋白，左旋多巴（levodopa,L-Dopa），IL-4，二甲基亚砜（DimethylSulphoxide），MTT均购自美国Sigma公司。重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor,rhEGF）购于美国Peprotech公司。牛垂体提取物（bovine pituitary extract,BPE）购于美国Invitrogen公司。10%新生小牛血清购自Hyclone公司。乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）购自美国Gibco公司。氢化可的松0.5 μg/mL，青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL，胰蛋白酶，台盼兰均系国产。培养瓶、96孔板和6孔板均购于美国Corning公司。显微镜：观察细胞用的是OLYMPUS CK2型号；细胞计数用的是OLYMPUS CKX41型号，照相用的OLYMPUSCH2型号；酶联免疫检测仪；流式细胞仪。标本经患者知情同意后取自18～35岁行包皮环切术的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素细胞的培养[1-4]将上述包皮放入含青霉素、链霉素浓度为100 IU/mL的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，取出后在超净台上用组织剪剪去皮下组织，再用PBS液反复彻底冲洗。移入含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶约20 mL的无菌瓶中，盖紧，于4℃冰箱中消化18～24 h。弃去胰蛋白酶，加入PBS液洗涤组织块数次。用眼科镊剥离角质层，可见角质层下面附着一层呈黑色的细胞，去除角质层后将组织块移入新的PBS液中振荡轻刮将黑素细胞层悬浮，再将含有黑素细胞的液体收集至离心管中。用PBS液反复离心洗涤细胞悬液3次，每次1 500转/min离心3 min。弃上清，将细胞沉淀物用黑素细胞生长培养基重新悬浮，并用台盼兰染色计数（细胞活力≥95%），按2×105个/cm2的细胞密度接种于6孔板中，于37℃、5%CO2条件培养48 h后换液去除未贴壁细胞，以后适时更新培养液。

1.2.2 黑素细胞鉴定[5]

1.2.2.1 左旋多巴（L-Dopa）染色 将传代纯化后的黑素细胞，经含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接种于已预先放置盖玻片的6孔板内，待细胞贴壁并稳定生长后弃去培养液，并用预热的PBS液洗涤数次。用2.5 g/L戊二醛固定后，加入用黑素细胞培养液配制的1 g/L L-Dopa，37℃孵育4 h，其间换液1次，风干后甘油封片，照相。

1.2.2.2 Fontana银染 在0.15%硝酸银溶液中加入适量氨水配制成氨银液，将传代纯化的黑素细胞用戊二醛固定后加入氨银液，避光浸染约30 min，PBS液漂洗3次后置倒置显微镜下观察，照相。

1.2.2.3 S-100蛋白免疫组化染色 将传代纯化后的黑素细胞，经消化后接种于已预先放置盖玻片的6孔培养板内，待细胞贴壁后去掉培养液。用2.5 g/L戊二醛固定后，PBS液洗涤数次，加入3%的H2O2，室温30 min，以去除内源性过氧化物酶；再次用PBS液洗涤数次，滴加1∶20稀释的羊血清，室温下处理15 min；加入1∶200兔抗S-100蛋白的多克隆抗体，4℃过夜；洗涤后加入生物素标记的羊抗兔抗体，37℃、湿盒孵育1 h，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃、湿盒孵育1 h。洗涤后二氨基联苯胺（DAB）染色，蒸馏水适时终止，苏木素复染后用加拿大胶封片，照相。

1.2.3 黑素细胞增殖的测定 采用四甲基偶氮唑蓝比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。倒置显微镜下观察，细胞培养至80%汇合时，弃培养液上清，加入含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶共1～1.5 mL，在75 cm2的细胞培养瓶内37℃孵育3～5 min，镜下观察约80%脱落，加入5 mL左右的含有10%新生小牛血清的MDCB-153培养基终止消化，转移细胞悬液到15 mL离心管，1 500转/min离心3 min，弃去上清，加入适量含有10%血清的MDCB-153培养基重悬细胞团块，吸取100 μL到一个无菌的500 μL的EP管中，加入等量的0.8%的苔盼兰溶液，室温下混匀5 min，吸取100μL混合液于血细胞计数板计数。按20000个/mL接种到96孔板中，每孔 150 μL，37 ℃，5%CO2孵箱过夜培养。

第2天，弃去培养基上清，加入新鲜的MDCB-153培养基100 μL/孔，备用。以无菌PBS配置的IL-4 溶液，其终浓度分别为 50，100，200 μg/L，备用。无菌加入100 μL相应浓度的IL-4溶液，同时设立PBS和空白对照组，各个浓度各设5个复孔。处理后分别培养24，48，72 h。相应处理时间后，分别弃去培养基上清，加入含MTT终浓度为0.5 g/L的新鲜MDCB-153培养基继续培养4 h，800转/min离心3 min，弃去培养基上清，加入150 μL的DMSO溶解甲瓒，37℃孵育15 min，于波长为495 nm处测吸光度值，记录数据，按公式计算其净抑制率。抑制率=（对照组-实验组）/对照组×100%，净抑制率=各组的抑制率-溶剂对照组（PBS）的抑制率。

1.2.4 黑素合成的测定 采用氢氧化钠（NaOH）法。将处理后的黑素细胞弃去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3 min后，分别计数后调整细胞数目，取等数量的细胞离心后重悬于100 μL的0.5 mmol/L的NaOH溶液中，37℃孵育1 h后，各管加入400 μL的蒸馏水稀释后，分别于405 nm处和450 nm测量吸光度值，按公式计算其抑制率。黑素合成抑制率=[1-（药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度）÷（对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度）]×100%。

1.2.5 流式细胞术检测 细胞培养，计数等如前，按2×105/孔接种到6孔板，浓度100 μg/L的IL-4处理组和PBS对照组，空白对照组设置如前，细胞处理72 h后，分别收集培养基上清到离心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，消化终止如前。分别收集细胞悬液转到相应的已经收集有各自上清的离心管里，1 500转/min离心3 min，弃去上清，加入无菌的PBS重悬细胞团块，1500转/min离心3min，重复3次PBS清洗过程后，弃去上清，加入PI溶液，室温避光孵育30 min，上机检测。

1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS10.0版统计软件进行分析。

2 结果

2.1 形态学结果 体外培养的正常人黑素细胞为双极、三极和多极的树突状细胞，细胞增殖良好,细胞树突之间交织成网，见图1。

2.2 黑素细胞鉴定

2.2.1 L-Dopa染色 第3代黑素细胞经0.1%LDopa染色后镜下见黑素细胞胞质及树突均被染成灰黑色，见图2。

2.2.2 Fontana银染 第3代黑素细胞经氨银液避光浸染30 min，细胞被染成黑色，见图3。

2.2.3 S-100蛋白染色 黑素细胞胞质及树突呈棕黄色阳性着色从而可以鉴定为黑素细胞，见图4。

2.3 不同浓度IL-4对人正常皮肤黑素细胞增殖率（%）的影响 黑素细胞增殖的测定结果见表1，2。

表1 不同浓度IL-4与PBS作用于黑素细胞后的抑制率的比较

表2 不同浓度IL-4作用于黑素细胞后的净抑制率比较

抑制率=（对照组-实验组）/对照组×100%。净抑制率=各组的抑制率-溶剂对照组（PBS）的抑制率。随作用时间增加，黑素细胞净抑制率逐渐增加，而且随IL-4的浓度增加，黑素细胞的净抑制率也逐渐增加，说明其对黑素细胞的作用呈现出时间和剂量的相关性。

2.4 黑素合成的测定结果 405 nm处和450 nm处分别测量吸光度值，按公式计算其黑素合成抑制率，均可见IL-4作用后黑素合成抑制率增加，而且IL-4组与PBS组比较差异均有统计学意义（P<0.05#），见表3。

表3 IL-4作用于黑素细胞后的黑素合成抑制率的比较

2.5 流式细胞术检测 浓度为100 μg/L的IL-4作用于黑素细胞72 h后用流式细胞术检测的结果：空白对照组黑素细胞凋亡率为4.0%，溶剂PBS组黑素细胞凋亡率为 6.7%，IL-4（100 μg/L）组黑素细胞凋亡率为59.2%。IL-4（100 μg/L）组黑素细胞凋亡率与空白对照组及溶剂PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

黑素的合成是个极其复杂的过程，在体内受细胞因子、金属离子、激素水平等各种因素的调节。黑素合成与机体免疫应答及细胞因子间相互作用已引起学者们的关注。Th细胞按其分泌细胞因子不同而分为Th1和Th2亚群，前者分泌IL-2，γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）；后者分泌 IL-4、IL-5、IL-10等[6]。Th1和Th2之间相互调节、相互制约，处于动态平衡，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫。Th1细胞分泌的细胞因子参与T细胞介导的细胞免疫，而Th2细胞分泌的细胞因子参与体液免疫。IL-4是一种Th2型细胞因子，具有调节Th1/Th2型细胞因子平衡作用[7]。隋连金等[8]采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法测定白癜风患者血清IL-4水平，并与正常对照组相比较，结果发现白癜风患者血清IL-4水平增高,且进展期高于稳定期，提示此种细胞因子可能参与白癜风发病，并与白癜风的活动有关。其作用可能与细胞因子及一些化学介质如：一氧化氮（NO）、神经肽（NPY）等的相互作用有关[9]。钟文俊等[10]发现白癜风患者在进行户外紫外线（ultraviolet radiation B，UVB）照射前局部组织液的IL-4、IFN-γ水平均较高，表明在白癜风的皮损处，Th细胞有较高的表达，而在治疗后IL-4、IFN-γ水平均下降，提示可能在UVB照射下Th细胞活性受抑制。黑素细胞的培养在皮肤色素性疾病、恶性黑色素瘤等的研究和治疗中具有重要意义。IL-4对体外培养的黑素细胞的作用国内尚无相关报道。本研究建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系后，用不同浓度的IL-4作用于黑素细胞后也发现IL-4对黑素细胞活力有抑制作用，能使细胞增殖力降低，黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率。这为临床应用IL-4治疗色素性疾病提供了实验依据，但是IL-4是通过什么机制达到这些作用还有待进一步的研究。

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［7］陈慰峰.医学免疫学[M].第3版.北京:人民卫生出版社，2000：92-94.

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