肖 俊 ，曹春瑜 ，周 静 ，汪卫红

（南昌大学第一附属医院a.肾内科；b.体检科，南昌 330006）

IgA 肾病（IgA nephropathy，IgAN）是一种免疫复合物介导的肾小球肾炎，以肾小球系膜区IgA沉积为主要特征，其临床病理表现多样，发病机制至今仍不清楚。目前认为其发病主要是由于免疫清除功能受损及黏膜水平抗原清除缺陷，与细胞免疫有着密切关系[1]。 以往研究[2]发现，IgAN 中存在 Th1/Th2 的失衡，但对是Th1还是Th2占优势仍有争议，而Th1/Th2失衡在IgAN中的作用亦尚未阐明。Th3细胞是不同于Th l、Th2的一类调节性T细胞亚群，具有免疫抑制调节功能，除抑制与调节免疫效应细胞的增殖、分化和活性，亦可抑制细胞因子产生，主要依赖其分泌的TGF-β1发挥作用，Th3在IgAN中的作用少见报道。本研究旨在通过观察IgAN患者外周血中Th1、Th2、Th3的表达变化，探讨IgAN免疫失调的发病机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2011年7月至2012年5月在南昌大学第一附属医院经肾活检确诊为IgAN患者（IgAN组）23例，男 8例，女 15例，年龄 22～45岁，病程 1～180个月。其中肉眼血尿5例，单纯性镜下血尿3例，蛋白尿合并血尿17例；合并高血压5例、水肿4例。均排除过敏性紫癜、系统性红斑狼疮、乙肝病毒相关性肾炎及肝硬化等，1个月内均未使用激素及免疫抑制剂。选择同期在本院体检的健康体检者（正常对照组）20例，男6例，女14例，年龄21～43岁。

1.2 方法

1.2.1 临床指标的检测

标本采集：1）血标本的采集。2组晨空腹抽取肘静脉血 5 mL，1 200 r·min-1离心 5 min，取血清，放置-70℃冰箱待测，避免反复冻融。2）尿标本的采集。取清洁晨尿送检尿常规；准确收集24 h尿液，加入防腐剂，混匀。混匀后，送检24 h尿蛋白定量。

检测方法：采用比色测定法、使用1650生化分析仪（德国Bayer公司）检测24 h尿蛋白定量、血尿酸及血肌酐水平，试剂盒购自德国Bayer公司；采用免疫比浊法、使用800双光径免疫比浊分析仪（美国Beckman Immage公司）检测血IgA水平，试剂盒购自美国BeckmanImmage公司，并根据较正的MDRD公式[3]计算肾小球滤过率（eGFR）。

1.2.2 外周血单个核细胞的分离

2组晨空腹抽取肘静脉血 3～5 mL，肝素钠抗凝，Ficoll（ρ=11 077）密度梯度离心法分离单个核细胞备用。

1.2.3 流式细胞仪检测Th1、Th2、Th3细胞比例

1）采用RPMI-1640调整单个核细胞浓度至5×105mL-1，每孔200 μL接种于96孔培养板中。将PMA 25 μg·L-1、ionomycin 1 mg·L-1、monensin 1.7 mg·L-1分别加入96孔培养板中，置37℃、310 CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）中刺激培养5 h。2）CD3、CD8为表面标志，用CD3+CD8+T细胞来代表CD4+T细胞。3)将刺激后的单个核细胞分为阴性对照、IFN-γ、IL-4 及 TGF－β14 管，均加入抗 CD3-PEcy5（美国Biosceince公司）、CD8-FITC （美国Beckman公司）单克隆抗体各10 μL，4℃避光孵育30 min。固定破膜后，再加入抗 IFN-γ-PE、IL-4-PE、TGF－β1－PE 单克隆抗体（美国Biolegend公司）或同型对照IgG1-PE各20 μL，室温避光孵育15 min。洗涤后，重悬待测。4）流式细胞仪检测：使用Facscalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）进行荧光检测，根据同型对照调整电压，设定阴性范围。同时，设立3种荧光单独标记的细胞染色管调整仪器荧光补偿。根据前向角和侧向角（FSS/SSC）圈定淋巴细胞设门G1，每份标本获取G1门20 000个细胞测定细胞表达。以CD3阳性设门，分析CD3+CD8-IFN-γ+即Th1细胞、CD3+CD8-IL-4+即 Th2细胞及 CD3+CD8-TGF-β1+即Th3细胞在CD3+T淋巴细胞中的比例。以 Cell-Quest、FlowJo software软件（美国 Becton Dickinson公司）收集分析数据。

1.3 高尿酸血症的判断标准

血IgA＞3.45 g·L-1定义为血IgA水平升高。血尿酸男性＞420 μmol·L-1，女性＞350 μmol·L-1定义为高尿酸血症。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

2组的性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2组一般资料比较见表1。

2.2 外周血 Th1、Th2、Th3、Th1/Th2 细胞水平的变化

IgAN组外周血中Th1细胞比例较正常对照组减少， 差异无统计学意义 （P＞0.05）；IgAN组外周血中Th2、Th3细胞比例均显著高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；IgAN组存在Th1/Th2细胞比例失衡，Th1/Th2细胞比值较正常对照组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表2。

表1 2组一般资料比较

表2 2组Th1、Th2、Th3细胞比例及Th1/Th2细胞比值的比较 ±s

表2 2组Th1、Th2、Th3细胞比例及Th1/Th2细胞比值的比较 ±s

#P＞0.05、*P＜0.05 与正常对照组比较。

组别 n Th1/% Th2/% Th3/% Th1/Th2细胞比值IgAN 组 23 13.14±3.11# 2.17±0.62* 3.17±1.15* 6.05±1.92*正常对照组 20 15.25±4.16 1.42±0.83 2.72±1.03 10.73±5.79

2.3 外周血Th细胞分布频率与临床相关性分析

IgAN 组血清 IgA 水平为（3.50±0.90）g·L-1，24 h尿蛋白定量为（0.70±0.60）g·d-1，血尿酸为（359.00±119.00） μmol·L-1，eGFR 为（61.10±42.10）mL·min-1。

相关性分析结果显示，IgAN组外周血Th2、Th3细胞比例与血清IgA水平呈正相关（r=0.468、0.521，均 P＜0.05），IgAN 组外周血 Th2、Th3 细胞比例与 24 h尿蛋白定量、血尿酸、eGFR水平均无相关性（r=0.016、0.124、-0.323、0.042、0.225、-0.473，均 P＞0.05）。

3 讨论

IgAN的发病与IgA免疫系统的异常密切相关[4]。IgA1由多克隆活性B细胞生成,而B细胞分泌IgA1的过程受T细胞调控。因此，T细胞免疫调节功能的紊乱，可能会导致失控的B细胞产生过量及异常的IgA1。陈琦等[5]通过比较IgAN及非肾炎患者扁桃体T淋巴细胞分布，认为IgAN与扁桃体局部免疫异常有关。近期研究[6]显示，T细胞尤其是辅助性T细胞的极化改变对IgA糖基化的形式改变及肾脏损害均有直接或间接的影响。由此可见，T细胞的调控失常可能是致病的IgA1产生的重要环节。

辅助性T淋巴细胞（Th）在诱导B细胞增殖分化、促进分泌各种免疫球蛋白中起重要作用。根据其分泌的细胞因子不同，主要分为Th1、Th2两个亚群。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2等，参与细胞免疫，介导细胞毒T细胞和巨噬细胞的活化，诱导产生分泌IgG2、IgG3的B细胞；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5等，介导体液免疫，促进产生分泌IgG4、IgE和IgA的B细胞。以往研究[7-10]发现，Th1/Th2平衡状态在肾脏疾病的不同表现类型中改变不同：在ANCA-相关肾小球肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎中，免疫反应以Th1为主导；在微小病变和原发性膜性肾病中，以Th2为主导的免疫反应占优势。对于Th1/Th2在人类IgA肾病致病中的作用，目前仍有争议[11]。 多数研究[12-15]认为，IgAN 中 Th1/Th2平衡向Th2偏倚，促进IgA分泌增多，从而参与IgAN 发病。 Nogaki F.等[12]研究发现，在自发性产生IgAN的ddY小鼠模型中，幼鼠呈Th1优势，但随年龄增长却呈Th2优势，IgA分泌增加。由此认为，IgA的产生可能与Th1/Th2平衡向Th2偏倚有关。Ebihara I.等[13]在单个细胞水平发现，IgAN 患者外周血分泌Th2类细胞因子的细胞比例增多，也显示IgAN患者免疫失衡呈Th2优势。另有研究通过ELISA[14]和 RT-PCR 法[15]同样证实了 IL-4 等 Th2类细胞因子在IgAN中表达增多，但也有少数研究取得了相反的结果，Lai K.N.等[16-17]用 ELISA 法检测IgAN患者外周单个核细胞培养上清中的细胞因子，发现Th1类细胞因子增多。然而，他们在mRNA水平的研究却又显示Th1和Th2细胞均增多。笔者通过流式细胞仪多重染色技术检测IgAN患者外周血Th1、Th2的分泌情况来观察Th1/Th2的平衡状态。结果显示，IgAN组外周血中Th2细胞比例明显增高，Th1细胞改变不明显，Th1/Th2细胞比值明显降低。证实IgAN存在免疫失衡，Th2优势明显，且与血IgA的水平呈正相关。

Th3细胞是由口服抗原诱导的小鼠肠系膜淋巴结中分离的一类能产生以TGF-β1为主的、独特的CD4+调节性T细胞亚群[18]，对免疫应答发挥负调节作用，是重要的免疫调节细胞。G.J.Prud’homme等[19]研究发现，Th3 细胞可以抑制 Th1、Th2 细胞过度活化,在纠正Th1/Th2的失衡过程中起重要作用。H.L.Weiner[20]研究发现，Th3 细胞可以依赖其分泌的TGF-β1，发挥其抑制Th1细胞介导的免疫应答和炎症反应。另外，Th3细胞是通过高分泌TGF-β1在维持免疫自稳中起着重要作用。杨军等[21]研究发现，在过敏性紫癜患儿急性期外周血Th3细胞减少，可能是导致其免疫失衡的重要原因，但目前少见国内外有Th3细胞在IgAN中的报道。以往研究[22]发现，IgAN患者血清中Th3类细胞因子TGF－β1水平升高，可促进IgA的产生，导致IgAN的发生。笔者的研究通过流式细胞仪多重染色技术检测Th3细胞比例，发现IgAN患者外周血Th3细胞比例增多，且与血清IgA水平呈正相关。因此，推测Th3细胞在外周血中的增多，一方面可能会抑制Th细胞介导的免疫应答反应，造成抗原的持续存在，引起异常IgA的清除障碍，导致IgA在肾脏的沉积。另一方面可能通过分泌TGF－β1，促使IgA产生增多，参与IgAN的发生与发展。

综上所述，本研究结果显示，IgAN患者外周血中存在Th细胞亚群的分布紊乱，表现为Th1/Th2平衡向Th2偏倚以及外周血中Th3的细胞比例增多。提示，T细胞亚群的分布紊乱可能在IgAN免疫发病机制中起重要作用，其可能的作用机制尚有待进一步研究。

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