姚换方，全灿，刘军，侯彩霞

(1.河北联合大学化学工程学院，河北唐山 063009； 2.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，北京 100013)

黄芩素是黄芩的主要活性成分，具有增强免疫、抗炎和抗焦虑等药理作用，被应用于医药、保健品及食品等领域[1-6],准确测定黄芩素的纯度对相关产品的质量监控具有重要意义。由于黄芩素受光照和pH等条件影响，稳定性较差，同时从中药材中提取分离纯化制备标准物质成本较高[7-8]，当前未见国内外有关黄芩素纯度标准物质的报道。

目前黄芩素的主要测定方法是高效液色谱法[9-10]。笔者通过高效液相色谱法(HPLC)和定量核磁技术(QNMR)对黄芩素标准物质进行纯度定值。黄芩素的分子结构如图1所示。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

傅里叶变换红外光谱仪：THRMO NICOLET IS10型，美国热电公司；

液相色谱-三级串联四极杆质谱仪：6410型，美国Agilent公司；

图1 黄芩素的分子结构

高效液相色谱仪：1100型，美国Agilent公司；

核磁共振仪：AV600型(BBI探头)，德国布鲁克公司；

卡尔费休库仑法水分测定仪：DL-39型，瑞士梅特勒公司；

溴化钾：光谱纯，北京博德恒悦科贸有限公司；

氘代二甲亚砜：99.9%，美国Cambridge Laboratoties(CIL)公司；

苯甲酸：99.9%，国家一级标准物质，中国计量科学研究院；

色谱纯乙腈：99.9%，美国Fisher Scientific公司；

色谱纯甲醇：99.9%，德国Merck公司；

卡尔费休试剂：HYDRANAL®-Coulomat AG-H型，德国Riedel-deHaen公司；

超纯水：电阻率为18.2 MΩ·cm，美国Milli-Q超纯水机制备。

1.2 标准物质的制备

黄芩素纯度标准物质原料通过定性分析确定主体成分，经过初步定量分析筛选使之满足纯度、均匀性初检要求后，将原料分装到清洗干燥过的棕色玻璃瓶中，经氮吹后，用真空包装密封储存，冷藏于4℃冰箱中。

1.3 定性分析

1.3.1 质谱分析

将样品配成约为10 μg／mL的甲醇溶液进行质谱分析。采用正离子模式扫描。质谱条件：气体温度350℃；气体流速9 L／min；喷雾器压力275.8 kPa；毛细管电压4000 V；质量范围：m／z60～300。

1.3.2 红外光谱分析

取样品约1 mg与已干燥的100 mg溴化钾混合均匀，压片，进行红外光谱测量。红外光谱实验条件：扫描范围为400～4000 cm-1；背景扫描(采样前采集背景)为16；分辨率为4；采样增益为4。

1.4 纯度定值分析

1.4.1 高效液相色谱(HPLC)分析

HPLC 条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(460 mm×250 mm，5μm，美国 Agilent 公司 )；乙腈-0.1%磷酸水溶液(体积比为35∶65)为流动相；检测波长为 260，265，275，280 nm，定值波长为275 nm；柱温为30℃；流速为1 mL／min，样品浓度为0.5 mg／mL。

1.4.2 定量核磁技术(QNMR)分析

QNMR条件：探头温度为25℃；谱宽为8012.82 Hz；脉冲宽度为4.2 μs，脉冲延迟时间为32 s；扫描次数为16次。

1.5 杂质分析

杂质分析主要包括水分和无机元素分析。

水分分析：采用卡尔费休库仑滴定-直接进样法进行水分的测定。实验条件：混合时间为35 s；搅拌速度：40%。

无机元素分析：将样品配成为0.1 mg/mL的甲醇溶液。利用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si等无机元素的含量。

1.6 样品均匀性检验和稳定性考察

根据JJF 1006-1994[11]的要求对黄芩素纯度标准物质进行了均匀性检验。从黄芩素纯度标准物质中随机抽取15个包装进行瓶间均匀性检验；任意选一瓶取7个子样，进行瓶内均匀性检验。对HPLC法的测量数据进行F检验和t检验。

黄芩素纯度标准物质稳定性考察按先密后疏的原则，用HPLC法检测在规定条件下保存的标准物质纯度随时间的变化情况。通常情况下，分别在第1，3，6个月进行稳定性监测。每次取5个包装，每个包装取一个子样，测3次，计算平均值，将5个包装测量结果的平均值作为检测结果。若检测结果的变动在定值结果不确定度范围内，说明其稳定。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

2.1.1 质谱分析

黄芩素的一级和二级质谱图分别见图2、图3。

图2 黄芩素的ESI-MS质谱图

图3 黄芩素的ESI-MS2质谱图

通过一级质谱图得到准分子离子峰[M+H]+m／z271约等于黄芩素的相对分子质量(270.24)加上氢的相对原子质量(1.0)。在二级质谱扫描中黄芩素主要发生两种裂解方式：一种是[M+H]+通过C环中1，2位C—O键和3，4位C—C键(RDA裂解)发生断裂得到碎片离子m／z169，m／z103，A环再进一步失去H2O，CO中性小分子碎片得到碎片离子m／z123，m／z95；另一种[M+H]+通过A环上脱去H2O，C2H2O中性分子碎片得到碎片离子m／z253和m／z211。根据黄酮类化合物的裂解规律，其中碎片离子m／z169比黄酮[A+H]+的m／z121多48，表明只含有酚羟基，碎片离子m／z103与黄酮[B1+H]+的质核比相同，表明B环中无取代基。

2.1.2 红外光谱分析

由红外光谱图 4 可知，3410 cm-1(6，7 位，νOH)，3090 cm-1(5 位，νOH)，1660 cm-1(νC=O)，1618，1586和1505 cm-1(黄芩素苯环骨架的νC=C)与文献报道[12]一致。

图4 黄芩素红外光谱图

2.2 纯度定值分析

2.2.1 高效液相色谱(HPLC)法分析

在波长为 260，265，275，280 nm 处进行检测，发现黄芩素和杂质在275 nm处响应值较大，因此定值波长选为275 nm。黄芩素含有多个酚羟基，具有弱酸性，容易在溶液中电离，造成峰形拖尾和不尖锐等问题，加酸可以抑制其电离，使它呈分子状态存在[13-14]，因此本实验在流动相中加入了少量的磷酸。

图5 黄芩素在275 nm波长下纯度定值HPLC图

2.2.2 QNMR法分析

通过脉冲延迟时间、扫描次数、脉冲宽度等实验参数的优化，用QNMR内标法测定了黄芩素的纯度。实验中以用于定量的内标峰(苯甲酸峰)和样品峰尽可能避开干扰为原则，分别把苯甲酸C-2，2'(δ=7.9457，2H)，黄芩素 C-3(δ=6.9287，1H)选为定量峰。

图6 黄芩素(内标苯甲酸)的QNMR谱图

表1 黄芩素纯度标准物质纯度测定结果 %

2.3 杂质的分析

水分的测定结果为0.538%。

无机元素 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si，S，Cl，K，Ca，Sc，Ti，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu ，Zn，Ga，Ge，As，Se，Br，Kr，Rb，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Sb，Te，I，Cs，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Hf，Ta，W，Re，Os，Ir，Pt，Au，Hg，Tl，Pb，Bi，Th 和 U的含量和为0.0000986%。

2.4 黄芩素纯度标准物质均匀性检验和稳定性考察

按1.6方法进行标准物质均匀性检验和稳定性考察，结果见表2、表3。

通过F和t检验法对黄芩素纯度标准物质的均匀性进行检验，发现瓶间和瓶内均匀性一致。在稳定性考察中发现定值结果没有出现显著的逐渐增大或减少的趁势，证明黄芩素纯度标准物质是稳定的。

2.5 不确定度评定

黄芩素纯度标准物质定值结果的不确定度来源有标准物质的定值过程引入的不确定度、标准物质的不均匀性引入的不确定度和标准物质的不稳定性引入的不确定度3部分组成。由标准物质均匀性检验和稳定性考察结果可知，该标准物质均匀性和稳定性良好，均符合标准物质的技术要求，故该部分不确定度可忽略不计[15-18]。

表2 黄芩素纯度标准物质均匀性检验结果 %

表3 黄芩素标准物质稳定性检验结果 %

2.5.1 高效液相色谱法的测量不确定度

(1)高效液相色谱法定值测量重复性引入的不确定度u1由测量结果的相对标准偏差计算得到，经计算u1=0.01%。

(2)各组分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度u2

综合考虑主成分和杂质化合物在相应检测波长处的响应，计算得u2=0.04%。

合成得高效液相色谱的测量不确定度：

2.5.2 QNMR法的测量不确定度

(1)QNMR法定值测量重复性引入的不确定度u3(A类不确定度)，由7次测量结果的相对标准偏差计算得u3=0.36%。

(2)黄芩素和苯甲酸的相对分子质量的不确定度

从IUPAC的原子量表中查得C，H，O中各元素的原子量和不确定度，经计算得：u(MC15H10O5)＝0.00699 g／moL ；u(MC7H6O2)＝ 0.00326 g／moL。

其不确定度在千位上可以忽略不计。

(3)苯甲酸内标引入的不确定度

由国家一级标准物质苯甲酸的证书可知其不

2.5.4 扩展不确定度

2.6 定值结果

黄芩素标准物质的纯度：

其中：Pm为水分含量；Pa为无机元素含量；PHPLC为HPLC-VWD定值主成分峰的百分比值；PQNMR为QNMR定值主成分的含量。

研制的黄芩素纯度标准物质定值结果为(98.8±0.8)%，k=2。

3 结论

对黄芩素纯度标准物质原料经过质谱、红外光谱定性分析后，分别进行了水分、无机元素含量分析。采用HPLC和QNMR两种定值方法对黄芩素原料纯度进行定值，并对黄芩素纯度标准物质进行了均匀性、稳定性检测和定值不确定度评定。研制的黄芩素纯度标准物质可应用于相关食品、中药产品、保健品的质量监控，为实现我国准确定量检测药品、食品与相关物质提供了标准物质资源和物质纯度标准。确定度为0.1%，按均匀分布考虑，苯甲酸内标引入的不确定度u4＝0.06%。

(4)天平称量引入的不确定度

样品称量使用分析天平的最小分度为0.1 μg，天平的变动性、检定误差等估计为0.5 μg，估算其标准不确定度为u5＝0.01%。

合成得QNMR法的测量不确定度：

2.5.3 定值结果的合成不确定度

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