赵敬慧，张守峰，刘 晔，陈 奇，苗富春，2，王林栋，李易潞，扈荣良

2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一种古老的人兽共患传染病，死亡率几乎为100%。狂犬病在我国大部分地区流行，严重危害公共卫生安全。在我国，除犬外野生动物可能也是重要的传播宿主和贮存宿主，野生动物狂犬病尚无系统研究。鼬獾（Melogalemoschata）是一种在我国华东、东南丘陵地区广泛分布的小型鼬科动物。本研究室对江西、浙江、安徽等地区野生动物鼬獾进行的狂犬病流行病学调查表明，上述地区鼬獾种群内存在狂犬病的独立传播，与人狂犬病关系密切［1－2］；并有一株鼬獾狂犬病毒变异株JX09－17（fb）与浙江地区犬源分离株同源性较高，可能与犬狂犬病溢出有关［3］。

该地区另一种数量较大夜行野生动物——黄鼬（Mustelasibirica），俗称黄鼠狼，广泛分布于我国各地区，生活习性与鼬獾相似，昼伏夜出，与鼬獾同为夜行动物。黄鼬狂犬病在波多黎各、格林纳达、多米尼加、古巴、南非和加勒比海岸地区均有报道，而且黄鼬分离株与犬源分离株核酸同源性较高，不同地区黄鼬分离株彼此差异较大，可能是分别感染了不同的狂犬病病毒株［4－9］。国内并没有黄鼬狂犬病的报道，为了解我国黄鼬是否携带狂犬病病毒，以及黄鼬、鼬獾、犬3种动物之间是否存在交叉感染，针对江西省部分地区野生动物黄鼬及鼬獾进行狂犬病流行病学监测，确定其狂犬病感染状况，为我国狂犬病的防治策略的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集2011年11月到2012年2月，在江西省共收集黄鼬脑组织样品1 102份，鼬獾脑组织样品210份，见表1。

表1 黄鼬、鼬獾脑组织样品来源地区分布Tab.1 Original place distribution of samples

1.2 直接免疫荧光检测（FAT） 按直接免疫荧光法进行狂犬病病原检测［11］。取小脑和脑干组织少许，在载玻片上制备组织触片；脑组织触片自然风干，置于80%丙酮溶液内固定（4℃，20 min），取出自然风干；以PBS（0.01 mol/L，p H7.4）稀释FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体 （由本实验室制备）为工作液；将触片置于染液内，37℃染色60 min；以洗液（1L PBS中加0.5 m L Tween－20）浸洗染色后触片，洗涤3次；洗涤后滴加80%甘油1～2滴，加盖玻片后荧光显微镜下观察。阴性对照为正常鼠脑组织，阳性对照为狂犬病病毒BD06株鼠脑毒。

1.3 狂犬病病毒分离 采用小鼠脑内接种方法［10］，对FAT检测阳性的样品进行病毒分离。制成10%悬液，于4℃以2 000 r/min离心20 min，取上清接种。1～3日龄昆明种乳鼠（购自长春生物制品研究所实验动物中心），约10只/窝，乳鼠和母鼠同笼饲养。乳鼠脑内接种0.03 m L/只，观察5～21 d。取发病或死亡的小鼠脑组织用于FAT和RTPCR检测。

1.4 N基因和G基因的扩增与序列测定 狂犬病阳性脑组织，TRIzol法提取总RNA，以特异引物进行反转录，用2对引物进行PCR，扩增狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白全基因序列，反应体系为：模板2 μL，10× PCR buffer 5μL，d NTP Master Mix 4 μL，Ex－taq DNA 聚合酶0.5μL，上下游引物各1 μL，双蒸水补至总体积50μL。反应条件为：95℃变性3 min后，于95℃30 s，52℃30 s，72℃100 s循环扩增30次，最后72℃延伸10 min。阴性对照为正常鼠脑组织，阳性对照为狂犬病病毒BD06株。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。如扩增获得1.7 kb（N基因）与1.8 kb（G基因）左右条带，回收PCR产物，送Ta KaRa公司，用扩增引物对PCR产物直接测序。拼接后核蛋白基因ORF（1 353 bp）及糖蛋白基因ORF（1 575 bp），见表2。

表2 N基因和G基因扩增引物Tab.2 Primers for amplification of N and G genes

1.5 DNA序列与分析 文件转换使用Clustal W软件包，用MEG4软件以邻位相连法构建系统发生树。本研究中用于比较分析的狂犬病毒N基因和G基因序列来源于GenBank，见图3，各毒株信息：GenBank登录号/毒株/宿主/来源地区/分离时间。

2 结 果

2.1 样品检测与病毒分离 1 102份黄鼬脑组织样品FAT检测结果呈阴性。210份鼬獾脑组织样品FAT阳性4份，可见明亮的苹果绿或黄绿色荧光颗粒，呈不同形状和大小。阳性鼬獾样品脑内接种3日龄乳鼠，共分离到4株狂犬病毒，分别命名为JX12－64、JX12－67、JX12－102、JX12－234，这4株街毒在乳鼠脑内接种后在7～15 d发病。发病乳鼠脑组织FAT呈阳性，见图1。

2.2 基因扩增产物鉴定 取5μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果4株狂犬病病毒在1.7 kb及1.8 kb处均可见目的条带，与预期大小相符，见图2。

2.3 GenBank登录号 4株新分离鼬獾源狂犬病病毒N基因和G基因序列已录入GenBank，登录号（图3）：JX12－64 N基因JQ950446，G基因JQ950447；JX12－67 N 基因JQ950448，G 基因JQ950449；JX12－102 N基因JQ950450，G基因JQ950451；JX12－234 N基因JQ950452，G基因JQ950453。

2.4 基于N基因和G基因构建系统进化树分析见图3，JX12－64，JX12－67，JX12－102，JX12－234，这4株狂犬病病毒同属基因1型，病毒之间N基因和G基因的同源性较高，分别为99.6%～100%和99.7%～100%，与浙江鼬獾分离株（ZJ－LA，F02等）和部分江西其他鼬獾分离株（JX08－45，JX08－48，JX08－47）同源性也较高，分别为99.6%～100%和99.7%～100%，进化关系较近，处在同一进化分支，而且与疫苗株（CTN181和CTN7）同源性较高，分别为94.6%～95.1%和92.9%～93.6%，与浙江和福建犬源分离株（ZJ－QZ，D01，FJ008，FJ009等）同源性88.2%～88.8%和87.6%～87.7%。

图1 FAT检测黄鼬和鼬獾脑涂片（A）鼬獾阳性脑组织涂片；（B）正常黄鼬脑组织涂片；（C）阴性对照；（D）阳性对照Fig.1 FAT of ferret badger and yellow mongoose brainA：Brain of ferret badger with suspected rabies；B：Yellow mongoose brain；C：Negative control；D：Positive control

图2 鼬獾狂犬病病毒N基因和G基因RT－PCR结果（A）N 基 因 1～4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，JX12－234；5：空白对照；6：阴性对照；7：阳性对照；8：DL2000 Marker；（B）G 基 因 1～4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，JX12－234；5：空白对照；6：阴性对照；7：阳性对照；8：250 bp MarkerFig.2 RT－PCR results of N and G genes from ferret badger rabies virus（A）N－gene；Lane 1 to 4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，and JX12－234，respectively；5：PCR－negative control；6： Uninfected brain negative control；7：Positive control；8：DL2000 marker（B）G－gene.Lane 1 to 4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，and JX12－234，respectively；5：PCR－negative control；6： Uninfected brain negative control；7：Positive control；8：250 bp marker

3 讨 论

黄鼬狂犬病主要报道于加勒比海沿岸地区，最早报道于1950年波多黎各，而后在古巴、格林纳达、多米尼加和南非等地也有报道［4－9］。我国并没有黄鼬狂犬病的相关报道，本研究首次对我国江西省黄鼬和鼬獾进行了狂犬病流行病学监测，不仅对该地区黄鼬和鼬獾感染狂犬病情况有初步了解，同时，为野生动物狂犬病相关研究提供流行病学数据，也为野生动物狂犬病控制提供依据。

图3 基于我国RV流行毒株N基因（A）和G基因（B）构建系统进化树（A）N基因；（B）G基因；各毒株信息：GenBank登录号/毒株/宿主/来源地区/分离时间Fig.3 The neighbor－joining phylogenetic tree of representative Chinese rabies virus isolates，using the N and G gene sequencesA：N gene；B：G gene；Information of RV：Gen－Bank no./isolate/host/origin/isolation date

黄鼬与鼬獾脑组织样品主要来源于江西省的新建县、安义县、永修县、高安县、南昌县、景德镇等地区，集中在江西省北部环鄱阳湖地区。对鄱阳湖地区野生动物黄鼬和鼬獾进行狂犬病流行病学监测，一方面因为这一地区鼬獾种群内存在狂犬病的流行，黄鼬与鼬獾都是夜行动物，有交叉感染的可能；另一方面鄱阳湖近年来持续干旱，枯水期提前，丰水期推迟，2011年年初到年底，湖区水域面积减少近三分之二，甚至部分地区出现饮水困难的情况，生态环境的变化可能导致野生动物的活动范围与区域的改变，也可能会增加狂犬病扩散传播的几率。本次监测结果显示，1 102份黄鼬样品，FAT结果都为阴性，210份鼬獾样品，FAT阳性4份，经MIT分离获得4株狂犬病病毒。对这4株病毒N基因和G基因遗传进化分析，新分离4株鼬獾源狂犬病病毒同属基因1型，同源性较高，与浙江省鼬獾分离株（ZJLA，F02等）和江西省其它鼬獾分离株（JX08－45，JX08－48，JX08－47）同源性在96%以上，遗传进化关系也较近，处在同一进化分支，但与浙江和福建犬源分离株（ZJ－QZ，D01，FJ008，FJ009等）同源性88%左右，与疫苗株CTN181和CTN7同源性较高。CTN181是上世纪50年代分离自我国山东淄博的疫苗株，与广东分离株（GN07）和贵州分离株（Guizhou＿A101和 Guizhou＿A103）同源性较高，遗传进化关系也较近，而且与本研究分离的鼬獾源狂犬病病毒同处一个进化分支。这一分支的病毒曾经于上世纪60年代左右在我国广泛流行［11］，为何近年来在鼬獾种群内流行，是由犬传播给鼬獾，还是由于鼬獾就是作为重要的贮存宿主，将病毒传播给犬和人，这需要长期的监测分析与研究。此前有研究显示，鼬獾源狂犬病病毒JX09－17（fb）株与江西、浙江、河北等地犬源分离株同源性较高，而与浙江和江西鼬獾分离株同源性相对较低，可能是由于犬狂犬病的溢出导致鼬獾感染［3］，这仍需进一步研究来确定。

以上结果表明，采样地区黄鼬样品中未发现狂犬病病毒感染，而鼬獾感染狂犬病病毒阳性率较高，说明在鼬獾种群内存在狂犬病的流行。从犬与鼬獾狂犬病病毒株同源性较低的情况来看，二者交叉传播或溢出的可能较低，黄鼬和鼬獾尽管都属于夜行动物，但二者交互感染的可能性很低。江西省野生动物种类繁多，数量较大，因此应加强该地区野生动物狂犬病的监测。

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